HPLC测定参归胶囊中丹参酮ⅡA的含量

参归胶囊是由丹参、当归、黄柏、青风藤、车前子、牛膝、杜仲等组成的中药制剂,具有清热除湿、活血补肾的功效,用于治疗痛风、痛风性关节炎等疾病。为更好地控制该制剂的质量,我们按新药要求对该制剂的质量标准进行了规范化研究[1]。本试验采用高效液相色谱法(HPLC)对胶囊中的丹参酮ⅡA进行了含量测定,为该制剂的进一步开发研究奠定基础。
1 仪器与试药
美国Waters高效液相色谱仪,waters2487检测器, Millennium32色谱工作站数据处理系统;Kromasil C18柱(5 μm，4.6 mm×150 mm);BP211D型电子天平(德国Sartorius公司);电热恒温水浴锅(江苏南通县通海电器厂)。丹参酮ⅡA对照品(批号110766-200417)购自中国药品生物制品检定所;甲醇为色谱纯,水为超纯水,其他试剂为分析纯;参归胶囊、阴性样品由哈尔滨医科大学第二附属医院药学部自制。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱为Kromasil C18柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),流动相为甲醇-水(78∶22),流速为0.8 mL/min,柱温为35 ℃,检测波长为268 nm。理论塔板数按丹参酮ⅡA峰计算应不低于2 000。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取丹参酮ⅡA对照品10.78 mg,置50 mL的棕色量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,精密量取2 mL,置25 mL棕色量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,即得(每1 mL含丹参酮ⅡA为17.25 μg)。
2.3 供试品溶液的制备
取本品内容物约3 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇50 mL,称定重量,加热回流1 h,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,过微孔滤膜(0.45 μm), 即得。
2.4 空白试验
为进一步考察试验设计及含量测定方法的可行性和专属性,取不含丹参药材的阴性样品制备阴性对照液,在上述色谱条件下测定,结果表明阴性对照液的色谱图在丹参酮ⅡA相应的保留时间附近无干扰峰,溶剂峰亦无干扰(见图1),表明本法可行,专属性良好。
2.5 线性关系的考察
分别精密量取对照品溶液4.0、8.0、12.0、16.0、20.0、24.0 μL,按上述色谱条件测定,记录峰面积,以丹参酮ⅡA峰面积为纵坐标,对照品进样量(μg)为横坐标,进行线性回归。得线性方程Y=3.162 2×106X+3.678 0×104,r=0.999 8。丹参酮ⅡA在0.069～0.414 μg范围内线性关系良好。
2.6 精密度试验
分别精密吸取同一对照品溶液,按上述色谱条件,连续进样6次,每次进样8 μL,记录对照品丹参酮ⅡA的峰面积积分值,结果其RSD=0.56%,说明所用仪器、方法精密度良好。ABC注：A.供试品;B.对照品;C.阴性对照;a.丹参酮ⅡA图1 参归胶囊HPLC图
2.7 稳定性试验
取同一批号胶囊10粒,倾出内容物,混匀,取约1 g,精密称定,按“2.3”项下方法制成供试品溶液并按色谱条件于0、12、24、36、48 h分别测定(n=5),结果RSD=0.40%,说明稳定性良好。
2.8 重复性试验
取同一批样品,配制供试品溶液共6份,在上述色谱条件下注入高效液相色谱仪,依法测定,记录峰面积,结果其RSD=1.33%,表明本方法有较好的重复性。
2.9 加样回收率试验
取6份已知含量的参归胶囊(含丹参酮ⅡA 0.343 7 mg/g),分别精密称定1 g,精密加入0.205 6 mg/mL丹参酮ⅡA对照品溶液,按“2.3”项下方法进行制备,依含量测定项下方法测定,结果表明本方法可行。见表1。表1 丹参酮ⅡA加样回收率试验结果
2.10 样品含量测定
取本品3批,每批取2份作平行样,按“2.3”项下方法制备供试品溶液,精密吸取10 μL,注入高效液相色谱仪,测定峰面积,计算3批样品含量,结果见表2。3批样品中,含丹参酮ⅡA的平均值为0.352 7 mg/g。表2 样品含量测定结果
2.11 丹参药材的含量测定
按2010年版《中华人民共和国药典》(一部)丹参项下的含量测定方法[2],测定3批丹参药材中丹参酮ⅡA的含量,分别为0.38%、0.31%、0.26%。
3 讨论
丹参为复方参归胶囊剂中的君药,其主要脂溶性成分为丹参酮ⅡA。现代药理学研究表明,丹参酮ⅡA对心肌缺血和心肌梗死具保护作用,能稳定红细胞膜、耐缺氧、抑制血小板功能和抗血栓形成等[3],是丹参的活性成分之一。本试验采用HPLC测定制剂中丹参酮ⅡA的含量,方法快速、简便、准确,可用于参归胶囊的质量控制。丹参酮ⅡA遇光不稳定,试验中丹参酮ⅡA对照品溶液的配制采用棕色容量瓶,供试品溶液应现用现配,且注意低温避光保存[4]。采用HPLC测定供试品溶液中丹参酮ⅡA的含量时,比较了不同的流动相[4-5],包括乙腈-水(65∶35)、甲醇-水(80∶20),但色谱峰与相邻峰的分离效果均不理想,将后者调节比例为甲醇-水(78∶22),结果分离效果良好。
本试验参考2010年版《中华人民共和国药典》(一部)丹参项下供试品溶液的制备方法,也曾查阅诸多文献,有以甲醇或乙醇为溶媒进行超声提取的,但有文献资料表明,对于丹参酮ⅡA的提取方法,加热回流提取法优于超声提取法,而丹参酮ⅡA易溶于高浓度乙醇,但水溶性成分在醇提时亦有相当部分被提取出来[6-7]。为避免更多杂质峰的干扰,故本试验采用甲醇加热回流提取,结果表明,样品中各组分的分离效果较好。
【参考文献】
[1] 王志安,王晓丹,李志明.人参败毒胶囊质量标准的研究[J].中国实验方剂学杂志,2001,7(3)：6-7.
[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社,2010：70.
[3] 胡迪,王光忠.丹参不同部位丹参酮ⅡA含量比较[J].中药材,2005, 28(1)：34.
[4] 张峻,李雪松,吴晖,等.高效液相色谱法测定三七丹参片中丹参酮ⅡA的含量[J].中国医院药学杂志,2001,21(6)：345-346.
[5] 原文鹏,刘林娜,马双成.HPLC法测定山丹酮缓释片中丹参酮类成分的含量[J].中国药房,2008,19(9)：681-682.
[6] 王启砚.HPLC法测定宁神补心片中丹参酮ⅡA的含量[J].中国药师,2003,6(12)：790-791.
[7] 任志会,苏会霞,柏艳柳.丹参脂溶性及水溶性成分集成提取工艺研究[J].中国中医药信息杂志,2009,16(3)：54.