正交试验设计优化杜仲总木脂素提取工艺

作者              单位

邓翀       陕西中医学院,陕西成阳,712046

颜永刚     陕西中医学院,陕西成阳,712046

杨乖利     陕西中医学院,陕西成阳,712046

陈锐       陕西中医学院,陕西成阳,712046

杜仲为杜仲科植物杜仲(Eucommia ulmoides Oliver)的干燥茎皮,特产于我国西部、西南部及长江中上游地区。《神农本草经》将杜仲列为上品,功效补中益精气、强筋骨、强志、安胎,久服轻身耐老。主要用于治疗肾虚腰痛、筋骨无力、妊娠漏血、胎动不安、高血压症。木脂素类化合物是杜仲化学成分中研究最多、结构最清晰、成分最明确的一类化合物,有关杜仲中木脂素类化合物的报道很多[1-3]。木脂素类成分是杜仲降压的主要组分[4]。但对其主要降压成分群木脂素提取工艺鲜有报道,本试验就杜仲木脂素的提取工艺进行研究,为杜仲木脂素成分分离纯化提供参考。

1 仪器与试药

UV-1102紫外分光光度仪(上海天美科学仪器有限公司),中兴高速万能粉碎机(北京中兴伟业仪器有限公司制造), GV-1102电子天平(武汉红旗光学仪器厂),萨多利斯GB2042电子天平(瑞典,0.01 mg),天平(济南市医疗器械厂)。

杜仲药材(市售品,经本院生药教研室王继涛老师鉴定为杜仲);松脂醇二葡萄糖苷(批号111537-200502)由中国生物制品检定所提供;水为蒸馏水;其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 含量测定方法

2.1.1 对照品溶液的制备

精密称取松脂醇二葡萄糖苷对照品4.43 mg置于25 mL的量瓶中,用甲醇溶解,定容至刻度,配制成浓度为0.177 2 mg/mL的对照品溶液。

2.1.2 供试品制备方法

精密称取杜仲药材粉末(60目筛)约5 g,以适当的溶剂为提取溶媒,按照试验设计的方法进行提取,滤过,提取液在80 ℃水浴浓缩,挥干溶媒,以80%甲醇溶解,定容于50 mL量瓶中。储存于4 ℃,冷藏待用。

2.1.3 标准曲线的绘制

精密吸取对照品溶液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL,分别置于10 mL的具塞试管中,挥干溶媒。分别加入0.5 mL 10%的变色酸、3 mL浓硫酸、1.5 mL蒸馏水,摇匀后沸水浴加热30 min,迅速冷却。以空白溶液为对照,在570 nm处测定吸光度,平行测定5次。得到标准曲线Y=0.178 2X+0.000 9,r=0.999 7,结果表明,对照品松脂醇二葡萄糖苷在0.035 4～0.124 0 mg范围内线性关系良好。

2.1.4 精密度试验

精密吸取松脂醇二葡萄糖苷对照品溶液0.4 mL置于10 mL具塞试管中,按“2.1.3”项下方法测定,连续5次重复测定。结果表明精密度良好,RSD=0.329%。

2.1.5 稳定性试验

精密吸取松脂醇二葡萄糖苷对照品溶液0.4 mL置于10 mL的具塞试管中,按“2.1.2”项下方法测定, 分别于0、10、20、30、40 min时间点测定吸光度。计算得RSD=1.641%。结果表明,松脂醇二葡萄糖苷对照品稳定性较好。

2.1.6 加样回收率试验

取已知含量的样品6份,每份1 g,精密加入一定量松脂醇二葡萄糖苷对照品溶液,以正交试验设计5号样品制备方法,照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液,按“2.1.3”项下方法测定平行测定6份样本。结果表明,松脂醇二葡萄糖苷回收率为102.273 9%±3.211 8%,RSD=3.14%。

2.2 总木脂素提取工艺考察

2.2.1 单因素考察

2.2.1.1 提取溶媒考察

精密称取杜仲药材粉末约5 g,分别以甲醇、乙醇为提取溶媒,溶媒用量为8倍,超声30 min,滤过,以相应溶媒定容于25 mL量瓶中,精密吸取药液0.4 mL,按“2.1.3”项下方法测定吸光度,以标准曲线法计算含量,结果以甲醇为溶媒时提取率较高。

2.2.1.2 提取方法考察

精密称取杜仲药材粉末约5 g,以甲醇为提取溶媒,溶媒用量为8倍,分别超声和回流30 min,滤过,以相应溶媒定容于25 mL量瓶中,精密吸取药液0.4 mL,按“2.1.3”项下方法测定吸光度,以标准曲线法计算含量,结果以超声提取时提取率较高。

2.2.1.3 甲醇浓度考察

精密称取杜仲药材粉末约5 g,分别以40%、60%、70%、80%、100%甲醇为提取溶媒,溶媒用量为8倍,超声30 min,滤过,以相应溶媒定容于25 mL量瓶中,精密吸取药液0.4 mL,按“2.1.3”项下方法测定吸光度,以标准曲线法计算含量,结果以甲醇浓度为80%时提取率最高。

2.2.1.4 溶媒用量考察

精密称取杜仲药材粉末约5 g,以甲醇为提取溶媒,溶媒用量分别为4、8、12、16倍,超声30 min,滤过,以相应用量的溶媒定容于25 mL量瓶中,精密吸取药液0.5 mL按“2.1.3”项下方法测定吸光度,以标准曲线法计算含量,结果以甲醇用量为12倍时提取率最高。

2.2.2 正交试验

选取提取时间、甲醇浓度、溶媒用量3个因素,以总木脂素含量作为评价指标,选用L9(34)正交表进行试验。根据“2.2.1”项考察结果设计因素水平,见表1。正交试验见表2,方差分析见表3。

2.2.3 结果分析

由极差分析结果可知,各因素对总木脂素的得率影响顺序为A>B>C,即甲醇浓度>提取时间>溶媒用量。甲醇浓度和时间是主要影响因素,故应选A3B3C1为木脂素提取的最佳方案。方差分析结果表明,超声时间对结果有显著影响。

2.3 验证试验

根据正交试验结果对A3B3C1工艺条件重复3次试验,以验证该工艺的合理性和稳定性,结果RSD=1.411%,测得总木脂素的平均含量为0.884 3%。最后确定的最佳提取工艺为甲醇浓度75%,溶媒用量为8倍,超声时间40 min。表1 因素水平表表2 正交试验及结果表3 方差分析表

3 讨论

本研究结果表明,杜仲木脂素的最佳提取工艺为甲醇浓度75%,溶媒用量为8倍,超声时间40 min。但目前中药工业化生产以加热回流和煎煮法为主,而超声提取方法由于现代仪器设备的限制,主要用于实验室中药及其制剂分析方面,该提取方法的建立为杜仲及其制剂化学成分分析提供了参考。

有文献报道,木栓层作为杜仲树皮的一组成结构,其厚度与不同变异类型杜仲皮及再生皮木脂素类活性成分的含量呈负相关关系[5]。木栓层中木脂素含量较低,木栓层的存在直接影响杜仲中木脂素的含量。本研究在对杜仲木脂素提取工艺研究前剃掉了杜仲的木栓层部分,避免其含量偏低引起的误差。

【参考文献】

[1] 赵玉英,成军.杜仲化学成分研究概况[J].天然产物研究与开发,1995, 7(3)：46-48.

[2] 尉芹,马希汉,张康健.杜仲化学成分研究[J].西北林学院学报,1995, 10(4)：88-93.

[3] 王文明,庞晓萍,成军,等.杜仲化学成分研究概况(Ⅱ)[J].西北药学杂志,1998,13(2)：60-62.

[4] 宋妍,许激扬.杜仲木脂素化合物降压药效学研究与机制初探[J].中医药学刊,2006,24(10)：1934-1936.

[5] 杜红岩,李钦,刘攀峰,等.不同变异类型杜仲皮及再生皮中木脂素类成分含量比较[J].中南林业科技大学学报,2010,30(7)：38-41.