中药尿酸利仙含药血清对TNF-a诱导的人血管内皮细胞VCAM-1mRNA表达的影响

作者                 作者单位

徐红    浙江中医药大学附属广兴医院(杭州市中医院) 杭州 310007

杨汝春  浙江中医药大学附属广兴医院(杭州市中医院) 杭州 310007

朱晓玲  浙江中医药大学附属广兴医院(杭州市中医院) 杭州 310007

Abstract Objective:To investigate the effect of NiaoSuanLiXian containing serum on expression of vascular cell adhesion molecule (VCAM1) mRNA in vascular endothelial cells induced by TNFα.Methods:Vascular endothelial cells was cultured and stimulated with different density(12.5,25,and 50 μg/ml) of TNFα in vitro,.At the same time,the cells were coincubated with 25 μg/ml density of TNFα for 8,16,24,and 48 hours.They were interved by different density (2.5%,5%,and 10%)of NiaoSuanLiXian containing serum. The expression of VCAM1 mRNA in vascular endothelial cells was detected by RTPCR.Results:The expression of VCAM1 mRNA in vascular endothelial cells induced by TNFα increased significantly(P<0.01),but no difference was noted between different density groups.The expression of VCAM1 mRNA in vascular endothelial cells induced by the 25 μg/ml density of TNFα increased significantly after 16,24,and 48 hour incubation(P<0.01).NiaoSuanLiXian containing serum at all experimental density significantly downregulated the expression of VCAM1 mRNA(P<0.05，P<0.01).Conclusion:Downregulating the expression of VCAM1 in vascular endothelial cells may be one of the mechanisms of NiaoSuanLiXian reducing the inflammatory injures.

Key words herbal NiaoSuanLiXian vascular cell adhesion molecule TNFα vascular endothelial cells

高尿酸血症是除高胆固醇血症、高血压、糖尿病、吸烟等冠心病(coroary heart disease,CHD)主要危险因素外的又一被公认的高危因子。如今控制高危因素的意义不仅在于调控目标值，而是通过抗血管壁的炎症来控制动脉粥样硬化(atherosclerosis,As)，减少心脏事件的发生。笔者用中药尿酸利仙颗粒剂治疗高尿酸血症，在临床应用多年取得较好的效果。本文旨在探讨中药尿酸利仙(含药血清)抗黏附、抗血管壁慢性炎症的分子机制。

1 实验材料

1.1 主要试剂

RPMI1640培养液 、胎牛血清(FCS)和青霉素、链霉素为英国Gibco Brl公司产品;二性霉素B、胰蛋白酶均为美国Sigma公司产品;RNA提取试剂Trizol、逆转录和PCR扩增试剂盒、引物合成均购自上海生物工程公司。

1.2 内皮细胞株

血管内皮细胞株(endotholial cell of vessels,ECV)由浙江中医药大学友情提供。

1.3 内皮细胞培养

将细胞复苏后，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液(内含青链霉素各100u/ml)培养，消化传代采用0.25%胰酶，0.02%EDTA，培养条件为5%CO2、37℃。

1.4 人血清制备

1.4.1 正常人血清制备

选择体检合格的年轻志愿者4名，晨各抽空腹血15ml，共60ml，离心，取血清，超滤，置-40℃冰箱保存备用。

1.4.2 含药血清制备

以上4名志愿者，给服尿酸利仙颗粒剂，每天2次定点、定时服用，第5天晨空腹将2次的药并一次服下，2小时后抽血各15ml，共60ml。离心，取血清，超滤，置-40℃冰箱保存备用。

2 实验方法

2.1 不同浓度TNF

α对人血管内皮细胞VCAM1mRNA表达的影响 分为4组，空白对照组(用10%正常人血清的RPMI1640培养液培养)，TNFα低、中、高浓度刺激组(在空白对照组基础上分别加入TNFα，浓度分别为12.5、25、50μg/ml)。

2.2 不同时间TNF

α对人血管内皮细胞VCAM1mRNA表达的影响 分为5组，空白对照组(10%正常人血清的RPMI1640培养液培养)，8、16、24、48小时TNFα刺激组(培养液中加入TNFα至终浓度为25μg/ml，分别孵育细胞8、16、24、48小时)。

2.3 中药尿酸利仙含药血清对TNF

α诱导的人血管内皮细胞VCAM1mRNA表达的影响 分为5组，空白对照组(用10%正常人血清的RPMI1640培养液培养)，TNFα刺激组(在空白对照组基础上加入TNFα至终浓度为25μg/ml)，尿酸利仙含药血清低、中、高浓度干预组(在TNFα刺激组基础上加入2.5%、5%、10%尿酸利仙含药血清，用正常人血清将血清总浓度补充至10%)，孵育细胞16小时。

2.4 RTPCR检测VCAM

1mRNA表达 将血管内皮细胞传代于培养瓶中，待长至60～70%融合时用无血清培养液同步24小时，按上述方法刺激。去上清，用预冷的PBS液洗涤1～2次。Trizol试剂提取各组细胞总RNA，两步法进行逆转录和产物聚合酶链扩增反应(RTPCR)，GAPDH作为内参照。PCR反应条件为：95℃5min;95℃30s，56℃30s，72℃30s，35个循环;72℃10min;扩增产物经1.7%琼脂糖凝胶电泳后，凝胶成象系统成像，用Bio Rad quanity one软件对条带进行半定量分析，VCAM1 mRNA的相对含量分别用其与GAPDH特异性条带的积分光密度之比值表示。引物序列：VCAM1，700bp，5′ AGT GGT GGC CTC GTG AAT GG 3′，5′CTG TGT CTC CTG TCT CCG CT3′;βactin，540bp，5′ GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA3′，5′ CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC3′。

2.5 统计学方法

数据用(±s)表示，用SPSS11.5软件对数据进行分析处理，组间比较采用F检验，P<0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 不同浓度TNF

α对人血管内皮细胞VCAM1mRNA表达的影响 低、中、高浓度TNFα刺激组细胞VCAM1mRNA表达均较空白对照组有显著增高(P<0.01)，见表1，图1。表1 不同浓度TNF-α对人血管内皮细胞VCAM-1mRNA表达的影响

3.2 不同时间TNF

α对人血管内皮细胞VCAM1 mRNA表达的影响 在25μg/ml的TNFα刺激下，内皮细胞VCAM1mRNA表达在16、24、48小时均显著上调(P<0.01)，但各刺激组间差异无统计学意义(P>0.05)，见表2，图2。

3.3 中药尿酸利仙对TNF

α诱导的人血管内皮细胞VCAM1mRNA表达的影响 与TNFα刺激组比较，低、中、高浓度的尿酸利仙含药血清干预组细胞VCAM1mRNA表达均显著降低(P<0.05，P<0.01)，见表3，图3。表2 不同时间TNFα对人血管内皮细胞VCAM1mRNA表达的影响图2 M：MARK;A：空白对照组;B：8小时TNFα刺激;C：16小时TNFα刺激;D：24小时TNFα刺激;E：48小时TNFα刺激表3 中药尿酸利仙对TNFα诱导的人血管内皮细胞VCAM1mRNA表达的影响

4 讨 论

动脉粥样硬化早期病变的形成包括两个重要环节：①血液中单核细胞(monocyte,MC)与内皮细胞(endothelial cell,EC)黏附，继而迁移到内皮下转变为组织巨噬细胞(macrophage,MP);②MP或平滑肌细胞(smooth muscle cell,SMC)摄取脂质后转变为泡沫细胞。因而单核细胞黏附于动脉内皮是AS损伤形成起始的重要事件[1]，介导单核细胞黏附的内皮表面黏附分子的表达是控制单核细胞在血管壁积聚的关键调控点。研究表明，介导血细胞和其他细胞尤其是血管内皮细胞黏附的黏附分子主要为前3种超家族[2]。

血管细胞黏附分子

1(VCAM1)又称INCAM或CD106，也属于免疫球蛋白超家族，用IL1、IL4和TNF诱导EC可促进VCAM1的表达。表达高峰在10～14小时，持续72小时。T细胞、NK细胞和单核细胞表面的整合素受体(VLA4)可与EC表面的VCAM1结合，并介导这些细胞黏附、穿越内皮[3]。VCAM1在内皮细胞、上皮细胞、单核细胞和淋巴细胞上均有表达[4]。VCAM1的表达机制尚不完全清楚。一般认为，其存在两种激活途径：①蛋白激酶C(PKC)的激活途径;②不经过PKC的激活途径[4]。

本实验观察到TNF

α能使培养的人血管内皮细胞VCAM1mRNA表达增强，当人血管内皮细胞暴露于不同浓度TNFα(浓度12.5、25、50μg/ml)后，其VCAM1mRNA表达均明显增加(P<0.01)。人血管内皮细胞在中浓度TNFα刺激下，VCAM1mRNA表达在16小时开始升高，到24小时表达最高，持续48小时。低、中、高浓度尿酸利仙含药血清(2.5%、5%、10%)能显著抑制TNFα刺激血管内皮细胞VCAM1mRNA表达(P<0.05，P<0.01)。本研究从基因水平阐明尿酸利仙颗粒对TNFα诱导内皮细胞VCAM1 mRNA表达的抑制作用，从体外实验证明尿酸利仙含药血清抑制ICAM1表达的作用是减轻TNFα诱导的人血管内皮细胞炎症损伤的机制之一。尿酸利仙(含药血清)能干预TNFα诱发动脉粥样硬化初期炎症反应及AS，对冠心病、高尿酸血症有预防和治疗作用。

【参考文献】

[1] Munro JM,Cotran RS.The pathogenesis of atherosclerosis:atherogenesis and inflammation\[J\].Laboratory Investigation,1988,58(3):249261.

[2] 高魏.黏附分子与动脉粥样硬化\[J\].南京军医学院学报，2000,22(1):2830.

[3] Bianchi G,Sironi M,Ghibaudi E et al.Migration of natural killer cells across endothelial cell monolayers\[J\].Immunol,1993,151(10):5135.

[4] Fougerolles AR,Qin X,Springer TA.Characterization of the function of intercellular adhesion molecule (ICAM)3 and comparison with VCAM1 and ICAM2 in immune responses\[J\].J Exp Med,1994,179(2):619629 .