卡波姆抑菌凝胶剂微生物限度检查方法的建立

　　卡波姆(carbomer)是一种新型高分子材料和优良的药用辅料，在药剂中已经得到了广泛的应用。
　　卡波姆被碱性物质中和后可成为良好的凝胶基质，常用浓度为0.1%一1.50%。卡波姆凝胶基质具有水溶性基质的特点，释药快，无油腻性，易于涂铺，对皮肤及粘膜无刺激性，是局部药物转运系统的优良基质，其薪度易受pH、金属离子和有机溶剂的影响。
　　当以卡波姆为基质的凝胶剂中加人具有抑菌作用的物质时，对其进行微生物限度检查或无菌检查时需用薄膜过滤法，但卡波姆在稀释液中会形成胶体溶液，无法通过0.45cm的滤膜，从而导致薄膜过滤法无法正常进行，故应先用适宜的方法去除卡波姆。本文在pH6.8的磷酸盐缓冲溶液中，利用硫酸锰与卡波姆结合形成沉淀，从而达到破胶目的的原理，消除卡波姆的干扰，使薄膜过滤顺利进行。
　　保妇康抑菌凝胶是一种以卡波姆为基质的凝胶制剂，其中含有苯扎氯钱和醋酸氯己定，对大多数细菌和真菌有杀灭和抑制作用9。本文将以保妇康抑菌凝胶为例说明如何进行含抑菌成分的卡波姆凝胶剂的微生物限度检查。
　　1材料
　　1.1供试样品保妇康抑菌凝胶(郑州新悦医药科技有限公司，规格:39·支。
　　1.2自制卡波姆凝胶取40g卡波姆一940，加人1000mL纯化水，边加边搅拌，待卡波姆充分溶胀后，再加人0.1mol·mL氢氧化钠溶液，边加边搅拌，直至凝胶变成透明状，分装，121℃高压灭菌20min，备用。
　　1.3试验设备HTY一2000集菌仪(杭州高得医疗器械有限公司);脱卸式薄膜过滤器(杭州泰林生物技术设备有限公司);微孔滤膜(杭州泰林生物技术设备有限公司，批号20120725，孔径0.45cm,直径约为50cm)，用前装在滤器上121℃灭菌30min.
　　1.4培养基营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基、甘露醇氯化钠琼脂培养基、嗅化十六烷基三甲铰琼脂培养基、pH7.0氯化钠一蛋白陈培养基等均由中国食品药品检定研究院提供。均按照中国药典2010年版二部附录要求配制，灭菌。
　　1.5试剂硫酸锰(天津市申泰化学试剂有限公司，批号111108),氯化钠(北京化工厂，批号20100912.),磷酸二氢钾(北京化工厂，批号20091015),氢氧化钠(天津市化学试剂三厂，批号100331)均为分析纯。
　　1.6菌种大肠埃希菌(Escherichiacodi)}CMCC(B)44102]、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusau-reus)[CMCC(B)26003]、枯草芽抱杆菌(Eacillussubtilis)}CMCC(B)63501口、白色念珠菌(Canclidaalbicans)[CMCC(F)98001」、黑曲霉(Aspergillusni-ger)[CMCC(F>98003]、铜绿假单胞菌(Pseudo-momsaeruginosa)}CMCC(B)10104」等均由中国食品药品检定研究院提供。
　　2实验方法
　　2.1菌液的制备按照中国药典2010年版二部附录要求制备。
　　2.2供试液的制备
　　2.2.1供试液a(常规法)取供试品10g，置盛有灭菌玻璃珠的锥形瓶中，加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白陈缓冲液至100mI，混匀，作为1:10供试液。
　　2.2.2供试液b(破胶法)取供试品lOg，置盛有
　　灭菌玻璃珠的锥形瓶中，加0.}%无菌氯化钠溶液60mL,充分摇匀，再加入0.1mol·mL硫酸锰溶液30mL,混匀，作为1:10的破胶供试液。
　　2.2.3供试液c(破胶法)取供试品10g，置盛有灭菌玻璃珠的锥形瓶中，加pH6.8无菌磷酸盐缓冲溶液60ml，充分摇匀，再加人0.1mol·ml硫酸锰溶液30mL,混匀，作为1:10的破胶供试液。
　　2.3验证试验
　　由于样品中含有抑菌剂苯扎氯钱和醋酸氯己定，所以直接采用薄膜过滤法进行试验。
　　2.3.1过滤速率的考察依次取供试液a、供试液b、供试液c各1mL，加0.9%无菌氯化钠溶液50mL稀释后过滤。结果表明供试液a无法通过0.45N,m的滤膜;供试液b可通过滤膜，但过滤速度非常缓慢;供试液c可通过滤膜，且速度较快，故选用供试液c作为供试液。
　　2.3.2破胶方法回收率的考察试验组:取“1.2”项下卡波姆凝胶10g，置盛有灭菌玻璃珠的锥形瓶中，加pH6.$无菌磷酸盐缓冲溶液60mI.，充分摇匀，加人103一104cfu的菌悬液1mL，摇匀，再加人0.1mol·mL‘硫酸锰溶液30ml，混匀，取上清液1mL注人平皿中，分别倾人营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基，待凝固后，细菌置30一35℃培养48h，霉菌和酵母菌置23一28℃培养72h。各试验菌同法操作。
　　菌液组:取10，一104cfu的菌悬液1mL注人90mL.0.9%无菌氯化钠溶液中，摇匀。取1mL注人平皿中，同试验组方法倾人培养基进行培养。供试品对照组:按试验组的方法和条件测定<1.2”项下卡波姆凝胶本底菌数。在3次独立平行实验中，由表1结果可知，试验组的回收率均大于70070,说明供试液制备过程中微生物几乎没有受到影响。
　　2.3.3细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证试验组:取供试液c1mL，加0.9%无菌氯化钠溶液SOmL稀释后过滤，用S00mL}H7.0无菌氯化钠一蛋白陈缓冲溶液冲洗滤膜，每次50mL，边冲洗边振摇.泵速为1.0:·mizi，在最后1次冲洗液中加人各阳性试验菌1mL，过滤，取出滤膜，菌面朝上，分别贴于营养琼脂和玫瑰红钠琼脂平板上，每种试验菌平行制备2张滤膜，细菌置30一35℃培养48h，霉菌和酵母菌置23一28℃培养72ho菌液组:分别取上述稀释的菌液1mL注人薄膜过滤器内过滤，贴膜。每种试验菌平行制备2张滤膜，分别测定所加的试验菌数。
　　供试品对照组:按试验组的方法和条件测定供试品本底菌数。稀释剂对照组:取稀释剂代替供试液，按试验组的方法和条件冲洗，在最后1次冲洗液中加人各阳性试验菌1mL，过滤，测定其菌数，计算试验组及稀释剂对照组菌落回收率。
　　进行3次独立平行试验，按照中国药典2010年版二部附录要求计算回收率。
　　2.3.4铜绿假单胞菌检查方法的验证取1:10的供试液c10mL，加0.9%无菌氯化钠溶液50mL稀释后过滤，用500mLpH7.0无菌氯化钠一蛋白陈缓冲液冲洗滤膜，每次50mL，边冲洗边振摇，泵速为160r·min，在最后1次冲洗液中加人78cfu铜绿假单胞菌，过滤，取出滤膜接种至100mI的胆盐乳糖增菌培养基内，按照中国药典2010年版二部附录要求进行方法学验证。
　　2.3.5金黄色葡萄球菌检查方法的验证取1:10的供试液c10m1.，加0.9%无菌氯化钠溶液50mL稀释后过滤，用500mLpH7.0无菌氯化钠一蛋白陈缓冲液冲洗滤膜，每次50mL，边冲洗边振摇，泵速为160r"min-'，在最后1次的冲洗液中加人83cfu金黄色葡萄球菌，过滤，取出滤膜接种至200mL的营养肉汤培养基内，按照中国药典2010年版二部附录iil7要求进行方法学验证。
　　2.3.6白色念珠菌检查方法的验证取1:10的供试液c10mL，加0.9%无菌氯化钠溶液50mL稀释后过滤，用500mLpH7.0无菌氯化钠一蛋白陈缓冲液冲洗滤膜，每次50mL，边冲洗边振摇，泵速为160r·min，在最后1次冲洗液中加人65cfu白色念珠菌，过滤，取出滤膜接种至100mL的沙氏葡萄糖液体培养基内，按照中国药典2010年版二部附录要求进行方法学验证。
　　3结果
　　3.1菌落计数验证结果在3次独立平行实验中，由表2结果可知，当冲洗量每膜达到500mL时，试验组和稀释剂对照组的回收率均大于70%，说明其抑菌作用消除，达到药典要求，故可照该供试液制备方法和计数法测定保妇康抑菌凝胶的细菌、霉菌及酵母菌数。
　　3.2铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌检查的验证结果如表3}5所示，阳性对照组中阳性菌均生长良好，阴性对照组均未长菌，说明该方法可以用于保妇康抑菌凝胶的控制菌检查。
　　4讨论
　　4.1卡波姆是一种高分子材料，当采用薄膜过滤法进行检验时，会阻塞膜孔，使过滤无法正常进行，所以含有卡波姆的制剂运用薄膜过滤法时，应首先考虑去除卡波姆的干扰作用。
　　4.2经比较，锰离子在高压蒸汽灭菌后，溶液的澄清度、过滤性、稳定性均优于Ca、Mg、Fe、Al,等，且无抑菌作用，所以选用硫酸锰溶液进行破胶。
　　4.3经多次试验发现，在pH6.8磷酸盐缓冲溶液的缓冲环境中，卡波姆与Mn2十更好地发生络合，形成沉淀，从而达到破胶的目的。该方法稳定可靠，破胶完全，去除了卡波姆对薄膜过滤速率的干扰;并且该方法不影响菌体的存活状态，故该方法适用于含抑菌成分的卡波姆凝胶剂的微生物限度检查。
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