LC-MS/MS法同时测定Beagle犬血浆中阿托伐他汀钙和盐酸吡格列酮的浓度

　　阿托伐他汀钙(atorvastatincalcium)为3一轻基一3甲基戊二酞辅酶A(HPVIG一CoA)还原酶抑制剂(他汀类)，而HMG一CoA还原酶是体内胆固醇合成的限速酶。他汀类药物能够显著降低血浆总胆固醇、低密度脂蛋白和三酞甘油水平厂。人体对他汀类药物的耐受性良好，与其他他汀类药物相似，阿托伐他汀钙的不良反应有便秘、腹胀、消化不良、头痛等一般不良反应，少见肝毒性和肌痛等严重不良反应。盐酸毗格列酮(pioglitazonehydrachloride)为嚷哩烷二酮类口服降糖药，通过提高对胰岛素的敏感性，用于治疗非胰岛素依赖型的2型糖尿病，主要有低血糖等不良反应.有研究表明，阿托伐他汀钙、盐酸毗格列酮体内均经CYP3A4代谢，盐酸毗格列酮还经CYP2C8代谢;此外，他汀类药物对CYP2C8酶的活性有一定的抑制作用。临床上高血脂并发高血糖患者常常同时服用阿托伐他汀钙和盐酸毗格列酮，根据它们的药动学性质推测，两药同服可能引起药动学的变化，会加重不良反应或降低药效。本文建立同时测定Beagle犬血浆中阿托伐他汀钙和盐酸毗格列酮的LC一MS!MS方法，用于Beagle犬血浆中阿托伐他汀钙、盐酸毗格列酮的药物浓度测定和药动学研究。
　　1仪器与试药
　　LC-30A高效液相色谱仪(日本Shimadzu公司);API4000串联四极杆质谱仪(配有电喷雾离子源，Analyst1,5.1分析操作软件，美国AppliedBio-systems公司);EppendorfAG5804R低温高速离心机(德国Eppendorf公司);X}一80A涡旋混合器(姜堰市康健医疗器具有限公司);梅特勒AE240电子天平(Mettler托利多仪器上海有限公司)。
　　阿托伐他汀钙(河北康泰药业有限公司，含量>99%),盐酸毗格列酮(济南中科一通化工，批号20110904，含量>99.55%)，地西伴(中国食品药品检定研究院，批号110805一200508);甲醇、乙睛为色谱纯(美国天地公司);纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司);其他试剂为分析纯。
　　阿托伐他汀钙片(厂家:PfizerIrelandpharrna-ceuticals，批号123511K，规格为20rng·片;盐酸毗格列酮片(天津武田药品有限公司，批号140}A，规格为15mg·片。
　　2动物
　　健康成年Beagle犬6只，普通级，体重10.5-3.0kg，雌雄各半，购自四川省成都市简阳达硕实验动物中心，动物许可证号:SCXK2008一24.
　　3 Lr一MS/MS条件
　　3.1液相色谱色谱柱:Shim-packXR-ODS(2.0mmx100mm,2.2m);保护柱:Shim一packGVP一ODS(2.0mmx5mm,2.2,m)，柱温400C，地西伴为内标。流动相:A相为5mmol·L-‘乙醋酸按(pH5.55),B相为乙睛，采用梯度洗脱(0.6min，10%B;0.6一1.2min，10%-X90%B;1.2-3.5min，90%B;3.5一4.1min，90%、10%B，5.5min结束);流速0.3mL·min;进样体积20p,Lo3.2质谱条件电离源:电喷雾电离源(TurboSpray)。检测:阿托伐他汀钙、盐酸毗格列酮均采用正离子模式;均用多反应离子检测(multiplereactionmonitoring,MRM;离子喷雾电离源(ionsprayvolt-age，IS):5.5kV;喷雾器温度(turbogastemperature，TEM);500℃;辅助加热气压(auxiliarygas,gas2):413.7kPa;雾化气气压(nebulizinggas,gas1);413.7kPa;气帘气气压(curtaingas,CUR):139.7kPa。定量分析的离子对:阿托伐他汀钙m/z559.5/440.6,盐酸毗格列酮m/z357.3/133.4;内标地西伴mlz2}5.5/193.1。图1为阿托伐他汀钙、盐酸毗格列酮和内标的二级离子扫描图。
　　4溶液制备
　　精密称取阿托伐他汀钙原料药10mg，置于10ml,量瓶中，用色谱甲醇稀释至刻度，配制成1mg·mL的标准储备液;再稀释成500,100,20,10、5,2,1、0.5ng·mL的系列工作液，置4℃冰箱保存。
　　精密称取盐酸毗格列酮原料药10mg，置于10mL量瓶中，用色谱甲醇稀释至刻度，配制成1mg/mL的标准储备液;再稀释成10000,2000,500,100,50,20,10,5ng·mL的系列工作液，置4℃冰箱保存。
　　精密称取地西伴对照品10rng，置于10mL量瓶中，用色谱甲醇稀释至刻度，配制成1mg·mL的标准储备液。将1mg·rnL的地西洋标准储备液用乙睛稀释至1ng·mL-I，含0.1%冰醋酸，作为沉淀血浆蛋白的乙睛溶液。置4℃冰箱保存。
　　5方法学考察
　　5.1血浆处理用160L空白犬血浆配制阿托伐他汀钙、盐酸毗格列酮血浆药物样品200L，加1ng"mL含0.1%冰醋酸的地西伴乙睛溶液600L，涡旋混匀2min。在14000:·min下离心10min，离心2次。取上清液，进样20},Lo5.2方法专属性取6个不同个体的混合空白血浆200L，加人600L不含内标的乙睛(含0.1%冰乙酸)，其余按“5.1”项下方法处理，进行LC-MS/MS分析，获得空白血浆样品的色谱图，与含一定浓度对照品和内标的血浆生物样本获得的色潜图及Beagle犬给药后1.51z获得的色谱图比较，判断血浆内源性物质是否干扰待测物和内标的出峰。阿托伐他汀钙、盐酸毗格列酮及内标的保留时间分别为2.3,2.5,2.7min左右。血浆内源性物质对药物、内标物质的测定无干扰，如图2.
　　5.3标准曲线和定量下限
　　取阿托伐他汀钙、盐酸毗格列酮系列标准溶液，使阿托伐他汀钙终浓度分别为0.05.,O.1,0.2,0.5,1,2,L0,50ng·mL，盐酸毗格列酮终浓度为0.5,1,2,10.,50,200,1000ng·mL，按"5.1”项下方法处理，在LC一MS,'1V1}条件下测定，以药物峰面积与内标峰面积比值为纵坐标(Y),以药物浓度(X)为横坐标进行线性回归，权重为i/r，阿托伐他汀钙和盐酸毗格列酮线性回归方程分别为:
　　Y=0.0669X+0.0023r=0.9941
　　Y=0.25X+0.00824r=0.9961
　　配制浓度为0.05ng·mL的阿托伐他汀钙血浆药物样品5份及浓度为0.5ng·mL‘的盐酸毗格列酮血浆药物样品5份，按“5.I”项下方法处理，测定浓度。
　　结果表明:阿托伐他汀钙、盐酸毗格列酮浓度分别在0.05}50_,0.5一1000ng=mL‘内有良好的线性关系。阿托伐他汀钙定量下限为0.05ng·mL-1,RSD为7.5%;盐酸毗格列酮定量下限为0.5ng·mL一1，RSD为14.7%。
　　5.4精密度取Beagle犬空白血浆，配制阿托伐他汀钙浓度为0.1、不40ng·mL的低、中、高质控(QC)样品各5份;盐酸毗格列酮浓度为1-25,800ng"mL‘的低、中、高QC样品名5份，按“5.1”项下方法处理，进行日内精密度考察。日间精密度按上述方法操作，连续重复3d，考察3d内日间精密度。结果见表1.
　　5.5提取回收率配制阿托伐他汀钙浓度为0.I,z一、40ng·n-YI的低、中、高Qc样品各，汾;盐酸毗格列酮浓度为1.25,800ng0nzL-’的低中、高QC样品各5份，按‘5.I"项下方法处理，提取回收率为测得药物和内标物峰面积的比值除以相同浓度的药物和内标物的纯溶液的峰面积比值其结果见表1。
　　5，6稳定性
　　5.6.1血浆约物样品室温放置241-Y稳定性配制阿托伐他汀钙浓度为40ng。nW的低、中、高QC样品各5份;盐酸毗格列酮浓度为I}5800rig0nxIl‘的低、中、高QC样品各5份室温放置24h后测定药物浓度。计算阿托伐他汀钙低、中、高浓度的分别为9:40}0,4.3%,3.0%。盐酸毗格列酮低、中、高浓度的分别为I3:0%,7.1%,2.2%。
　　5.6.2样品处理后4Lf,'.置川h稳定性配制阿托伐他汀钙浓度为0.1,2,40ng·ml的低、中、高QC样品各5份;盐酸毗格列酮浓度为I.,25.,800ng·YT1L的低、中、高QC样品各5份，按“5.1”项下方法处理,4℃放置24sa后测定药物浓度。讨一算阿托伐他汀钙低、中、高浓度的RSD分别为14.6%,7.9%,'7.9%，盐酸毗格列酮低、中、高浓度的分别为8.1%,6.0%、5.5%。
　　5.6.3冻融稳定性配制阿托伐池们钙浓度为0.1,2,4Ung·rtiI的低、中、高QC样品各5份;盐酸毗格列酮浓度为1,25,grig}rnL的低一中高QC样品各5份，放置一r70℃冰箱，z4Ii后取出在常温融化后又放置一7C℃冰箱保存至少1}Ii，如此反复3次，按“5.1m项下方法处理，计算阿托伐他汀钙低.、中、高浓度的R.Sv分别为115%、48%、26%，盐酸毗格列酮低、中、高浓度的RSD分别为7.1%,13.1%,3.4%。
　　5.6.4长期稳定性配制阿托伐他汀钙浓度为0.1,2,40ng·mL的低、中、高QC样品各5份;盐酸毗格列酮浓度为1,25,$00ng·mL的低、中、高QC样品各5份，放置一70℃冰箱，保存2个月，按"5.1”项下方法处理，计算阿托伐他汀钙低、中、高浓度的RSD分别为8.2%,8.8%,6.5%,盐酸毗格列酮低、中、高浓度的RSD分别为7.5%,2.8%,84%。
　　5.7基质效应配制阿托伐他汀钙浓度为0.1,2,40ng·mL.的低、中、高QC样品各5份;盐酸毗格列酮浓度为1,25,800ng·mL的低、中、高QC样品各5份，按“5.1”项下方法处理，其峰面积作为基质效应中的分子。另用纯水替代血浆，按上述处理后进样，其峰面积作为基质效应分母。结果阿托伐他汀钙低、中一、高浓度基质效应(A}IE)分别为89.5010,94.3%,83.4%，盐酸毗格列酮低、中、高浓度i}IE为103%,103%}$8.8%。
　　6Beagle犬单次口服阿托伐他汀钙片或盐酸毗格列酮片后血药浓度测定。
　　6只健康Beagle犬，分2组，每组3只，给药前禁食12h,1组口服市售阿托伐他汀钙片1片，另1组口服市售盐酸毗格列酮片1片，在给药前及给药后0.1%,0.33,0.5,0.}75、1.,1.25、12【氏24h采集3}}L前肢静脉血至肝素抗凝管中，在X000r"min一下离心10min，取上清液。用200},L上清液按“5.I”项下方法处理，测定药物浓度，绘制药物浓度一时间曲线。Beagle犬单次口服阿托伐他汀钙和盐酸毗格列酮后药物浓度一时间曲线见图i，主要药代动力学参数见表2.
　　7讨论
　　目前有关阿托伐他汀钙、盐酸毗格列酮的HPLC,LC一MS/MS检测方法己有许多报道但HPLC受血浆内源性物质影响大，分析时间长。
　　目前尚未报道同时测定阿托伐他汀钙和盐酸毗格列酮的LC一MS/MS法。本文所选液相色谱条件及质谱条件在参考文献的基础上加以优化，能够同时测定阿托伐他汀钙、盐酸毗格列酮。另外，本文提取方法简单快捷，提高了药物的分析测定效率。由于阿托伐他汀钙在体内能够代谢为对一经基和邻一轻基阿托伐他汀酸及阿托伐他汀内酷，这前2种代谢产物又能与相应的内醋代谢产物在体内转换，本文所用提取溶剂可防止阿托伐他汀钙代谢产物与母药之间的转化[13]，提高分析准确性，而这并不影响盐酸毗格列酮、地西洋的测定。由于阿托伐他汀钙生物利用度较低(约14%>，体内浓度不高，本文所建立的方法能够准确地评价阿托伐他汀钙的体内情况。
　　本文建立的LC一1'IS/1}IS方法准确、快速，血浆内源物质不干扰样品测定，回收率、精密度等符合生物样品分析要求，可用于Be}}2<e犬血浆中阿托伐他汀钙、盐酸毗格列酮的浓度测定和药动学研究。
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