超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱对血清中结合型胆汁酸的定性分析研究

　　胆汁酸是胆汁的重要成分，它们在肝脏中合成后分泌到胆囊或肠道中，主要与甘氨酸或牛磺酸结合形成次级胆汁酸，健康人体内仅有少量的游离胆汁酸循环流动。当出现肝脏和肠道疾病时，会扰乱胆汁酸的合成、代谢，进而影响到血清、肝脏、胆囊、尿液中胆汁酸的浓度。因此，胆汁酸浓度的升高可作为肝脏疾病的指标。近年来的研究发现胆汁酸不仅可作为生理溶剂协助脂溶性维生素和脂肪的吸收、转运和分布，还可作为信号分子激活核受体并调节胆汁酸和胆固醇代谢2一5。胆汁酸也具有细胞毒性，当胆汁酸在体内超过正常水平时，会引起肝损伤，胆汁淤积症，严重可诱发肝癌。因此，如何从复杂的生物基质中快速筛选出不同种类的胆汁酸显得尤为重要。
　　由于胆汁酸物化属性间的差异，如同分异构体的存在，使得检测胆汁酸具有一定的难度。有研究者利用核磁(NMR)、气相色谱与质谱联用技术(GC一MS)、高效液相色谱(HPLC)或液质联用进行检测。气相色谱与质谱联用技术(GC一MS)需要将样品进行衍生化、前处理耗时烦琐;核磁(NMR)需要样品具有较高含量和纯度;近年来，液质联用技术(LC一MS)技术被广泛应用于胆汁酸的定性和定量分析，此方法简便快捷，大大减少样品制备过程，但目前大多数研究者均采用多反应监测模式(MRM)进行生物样本中胆汁酸的定性与定量分析，由于该方法只能定性与定量检测样品中已知的胆汁酸分子，所以无法对未知胆汁酸进行定性分析。
　　本研究采用超高效液相色谱一四极杆一飞行时间质谱仪(UPLC一Q一TOF一MS)，利用1VISE采集方式，在1次液质分析中同时获得高精确的母离子及碎片离子信息，并通过母离子与其碎片离子具有相同色谱行为的特性进行母一子离子的关联归属，以标准结合型胆汁酸为研究对象，对常见结合型胆汁酸的质谱学性质进行研究，建立了定性检测结合型胆汁酸方法，以期为胆汁异常相关疾病的研究提供良好的分析工具。
　　1仪器与试剂
　　ACQUITY超高效液相色谱分析系统，配置AC-QUITY自动进样器;Q一TOF高分辨四极杆与飞行时间质谱仪;Masslynx4.1数据处理系统和ACQU-TTYUPLCBEHC1:色谱柱(100mmx2.1mm,1.7Nm)均为美国Waters公司产品;超纯水系统(法国MILLIPORE公司)。
　　胆汁酸标准品包括牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA),牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)、牛磺去氧胆酸(TDCA),牛磺胆酸(TCA)、牛磺石胆酸(TLCA)、甘氨胆酸(GCA)、甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)及甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)，均购自美国Sigma一Aldrich公司;色谱纯甲酸和亮氨酸脑啡肤(美国Sigma一Aldrich公司);流动相试剂甲醇、乙睛均为色谱纯(美国Sigma一Aldrich公司)，实验用水由超纯水系统制备。
　　2试验方法
　　2.1标准溶液配制取各标准品，用甲醇溶解并定溶到1mg·mL，再根据具体分析需要，将各标准溶液进一步稀释至10},g·mL进行LC一MS分析。
　　2.2样本处理采集正常人血液与肝病患者的新鲜血液，4000r·min_,min离心后取上清液，立即置于一20℃冰箱保存备用。分析样本时，取100},L血清加400L乙睛，漩涡震荡1min,14000r·min离心10min，取上清液进行LC一MS分析。
　　2.3色谱质谱条件
　　色谱条件:流动相A为高纯水(含0.1%甲酸)，流动相B为甲醇(含0.1%甲酸)，流速为0.35mL·min。流动相B起始浓度为3%(体积比)，维持0.5min,7.Smin内线性增加至80%，然后在8min内增至98%，保持5min，再在0.5min内升至100%，保持3min，最后在0.5min内降至3%，平衡色谱柱5min。进样量为5},L，柱温50℃，样品室温度维持在4℃。质谱条件:采用电喷雾离子源，V飞行模式。
　　负离子模式下，毛细管电压2.6kV、锥孔电压40V、离子源温度120℃、电喷雾气(脱溶剂气)温度3500C、电喷雾气流量(脱溶剂气流量)450L·h、锥孔气流量50L/h、数据采集范围m/z50一1000。质谱仪采用甲酸钠进行多点校正，使用亮氨酸脑啡肤作为外标物对目标物进行精确质量锁定。四极杆飞行时间质谱采集速率为0.5s，间隔0.1soMSE由“低碰撞能(5eV)”与“高碰撞能(50eV)”两种扫描交替构成，分别记录母离子及碎片信息。
　　3结果与讨论
　　3.1色谱与质谱条件的优化血清样本经有机溶剂按体积比1:4沉淀后，取上清液上机分析。由于血清中含有丰富的磷脂类，若采用乙睛为流动相B进行洗脱会发现磷脂色谱峰拖尾现象严重，更换甲醇为流动相B后峰形改善。说明甲醇可有效地将磷脂洗脱出色谱柱(图1)03.2标准结合型胆汁酸分子离子的裂解采用仪器所设的MSF'技术，在每1次全扫描过程中分别采用低高碰撞能量对样品进行分析，可分别记录母离子及碎片信息。
　　负离子模式下，甘氨结合型胆汁酸的M一H-离子在高能量碰撞下裂解均能得到m/z74.02的碎片离子CZH4NOZ，所以先在高碰撞能量得到的基峰强度色谱图(basepeakintensity,BPI)中提取m/274.02子离子流色谱图(EIC图)，再根据母离子与其碎片离子具有相同色谱行为的特性进行母一子离子的关联归属，即可得到样品中各甘氨结合型胆汁酸的[M-H一的出峰位置(图3-B)。与此类似，负离子模式下，牛黄酸结合型胆汁酸的[M一H口高能量碰撞下裂解均能得到m/79.95106.98(CZH403S一),S3种碎片离子，又由于m/z124.00(CZH6N03S一)离子的丰度最高，故选择其作为牛黄酸结合型胆汁酸的特征离子。
　　3.3利用MSE技术定性分析血清中结合型胆汁酸根据以上质谱学规律，可快速定性分析出样本中结合型胆汁酸。在高碰撞能量的色谱图中分别提取m/z74.02的EIC图，可得到一系列的色谱峰，分别标记为G一系列(图4一I一B)。由G2,G3,GS,G7的高碰撞能量下质谱图可发现，4种化合物的[M一H〕一裂解均能得到m/z74.02的子离子碎片，提示胆汁酸中存在甘氨酸残基(图5)oG2,G6和G7具有相同质荷比并由相同的元素组成，可推测为同分异构体。与标准品进行比对后可确定G2,G6分别为甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)、甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)。分析G1一S,G4一S与GS一S质谱图发现，在高碰撞能量下均能得到m/z%.%(HS04)和m/274.02(CzH4NOZ)2种碎片离子，提示分子中同时存在甘氨酸基团和硫酸基团;同时，高碰撞能量下各甘氨结合型胆汁酸的「M一H〕一离子亦会丢失S03形成[M一S03〕一离子峰(图6)。根据以上质谱规律，可推测G1一S,G4一S与GS一S为甘氨结合型胆汁酸硫酸酷盐，但无法确定硫酸基团具体结合在固醇骨架的C一3还是C一7位。检索HMDB(HumanMetabolomeDatabase)数据库，可初步确定G1-S,G4-S,GS一S为甘氨熊脱氧胆酸一3一硫酸醋(GUDCA-3S)，甘氨熊脱氧胆酸-3一硫酸醋(GCDCA-3S)，甘氨熊脱氧胆酸一7一硫酸醋(GCDCA一7S)，下一步需购买标准品进一步确定(表1)。
　　负离子模式下定性分析牛黄酸结合型胆汁酸(图4一I一C)，在高能量的色谱图中分别提取m/z124.00的EIC图，可得到一系列的色谱峰，分别标记为T一系列。T2,T3,T4与TS的高能量下MSE的质谱图可发现四种化合物的「M一H〕一在高碰撞能量下裂解均能得到m/z79.95(S03),106.98(C2H403S),124.00(C2H6N03S一)3种子离子碎片(图7)，提示胆汁酸中存在牛磺酸残基。其中T2,T4与TS为同分异构体，与标准品比对其色谱行为和质谱行为后确定三者分别为牛磺酸熊脱氧胆酸(TUDCA)、牛磺酸鹅脱氧胆酸(TCDCA)和牛磺酸脱氧胆酸(TDCA)。另外，色谱峰T1一S的MSE高能量质谱图中发现，除了具有牛磺酸结合型胆汁酸3种典型的子离子碎片m/z79.95(S03)，106.98(C2H403S一)，124.00(C2H6N03S)外，还出现丰度很高的m/z96.96离子(图8)，提示分子中存在HS04基团，推测其为牛磺去氧胆酸硫酸酉旨。
　　根据以上质谱学规律，分析健康人血清与肝病患者血清中结合型胆汁酸，最终定性出4种G-BAs,4种G一BA一Ss,4种T一BAs和1种T一BA-5(表1)。可见，利用全信息串联质谱(MSE)技术，由“低碰撞能”与“高碰撞能”2种扫描交替构成，分别记录母离子及碎片信息，利用两者具有相同的色谱行为特性进行母一子离子的关联归属，最终可确定血清样品中结合型胆汁酸的种类。同时，此方法也可应用于其他生物样品中未知物的分析，能够快速筛选出一系列类似化学性质的化合物。
　　参考文献
1 Bobeldijk I,Hekman M,de Vries-van der Weij J,et al.Quantitative profiling of bile acids in biofluids and tissues based on accurate mass high resolution LC-FT-MS:compound class targeting in a metabolomics workflow.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2008,871(2):306
2 Vlahcevic ZR,Pandak WM,Stravitz RT.Regulation of bile acid biosynthesis.Gastroenterol Clin North Am,1999,28(1):1
3 Hofmann AF.The continuing importance of bile acids in liver and intestinal disease.Arch Intern Med,1999,159(22):2647
4 Chiang JY.Bile acid regulation of gene expression:roles of nuclear hormone receptors.Endocr Rev, 2002,23(4):443
5 Zollner G,Marschall HU,Wagner M,et al.Role of nuclear receptors in the adaptive response to bile acids and cholestasis:pathogene BPI and therapeu BPI considerations.Mol Pharm,2006,3(3):231
6 Latta RK,Fiander H,Ross NW,et al.Toxicity of bile acids to colon cancer cell lines.Cancer Lett,1993,70(3):167
7 Hofmann AF.The continuing importance of bile acids in liver and intestinal disease.Arch Intern Med,1999,159(22):2647
8 Künnecke B,Bruns A,von Kienlin M.Non-invasive analysis of gallbladder bile composition in cynomolgus monkeys using in vivo 1H magne BPI resonance spectroscopy.Biochim Biophys Acta,2007,1771(4):544