艾灸燃烟自由基分析

　　艾灸是中医的基本疗法，其灸材为艾绒，由艾叶加工而成，以靳艾最佳。艾灸机制是温热作用、光辐射作用、药物作用等综合效应，并通过刺激穴位，在经络传输引起一系列的生理、生化、免疫等方面的变化来调整机体功能，达到防病治病的目的。胡国胜等人对艾灸进行研究后发现，若施灸部位不在经络输穴处，则治疗效果明显下降或消失。最近的研究认为艾燃烧时产生的一些辐射能谱在0.8一5.6N.,m间的有益于身体的红外线，表明艾灸可以产生以近红外能谱为主的近红外及远红外辐射，其峰谱位于附近。艾灸药物作用的物质基础是艾灸燃烟，已有研究表明艾灸燃烟中含有大量的挥发油与黄酮一、揉酸和长链脂肪烃等的裂解与氧化产物，而这些都是艾叶燃烧产生的稳定化学成分。郭亚力等人指出香烟的燃烧过程中，发生了复杂的使学反应，生成各种新化合物及自由基，这些自由基分布在焦油和气相中。以此推测艾叶的燃烧过程同样产生自由基，但是关于艾烟中自由基的检测的文献极少，而且艾烟是艾灸的物质基础。自由基能影响酶的活化、白细胞的免疫反应，参与人的衰老过程，导致基因诱变与细胞凋亡。据报道与研究，由氧自由基所引起的疾病，已超过100余种。最为普遍的即是引起细胞衰老，还有心脏病、动脉硬化等，严重的甚至于癌症。
　　1,1一二苯基一2一苦基阱自由基(DPPH)是1种稳定的自由基，在乙醇溶液中呈深紫色，当给予质子形成非自由基DPPH-Hla，或在一定条件下与其他自由基发生自由基碎灭，其颜色减褪，褪色程度与抗氧化剂的清除能力或其他自由基的数量呈定量关系.如果艾灸燃烟中不存在自由基，那么艾灸燃烟对DPPH溶液的作用应该相当十用甲醇吸收艾灸燃烟中稳定化合物对DPPH的作用。如果存在自由基，那么2种实验结果之间会存在1个差值，这个差值可以作为判断艾叶燃烟中自由基相对含量的依据。通过DPPH法来证明艾灸燃烟自由基的存在和比较不同贮存期艾灸燃烟中自由基的相对浓度变化，以便进一步阐明艾灸的生物活性与安全性，此方法经济简单。
　　1材料和试剂
　　1.1仪器JA2103N电子分析天平(上海民桥精密科技仪器有限公司);UV/V一16/18型紫外/可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司);SHB一111循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司).
　　1.2材料与试剂
　　材料:1,3,5年艾条，南阳百草堂天然艾草制品有限公司，生产日期均为2011年1月15日。分析时间2012年3月一4月。
　　试剂:DPPH(分析纯)，梯希爱(上海)化成工业发展有限公司;无水甲醇(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司;抗坏血酸(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司。
　　2实验部分
　　2.1DPPH溶液的配制准确称取DPPH，用无水甲醇配制成浓度为500Nmol·L的溶液，每次试验现配现用。
　　2.2艾叶燃烧装置自行设计的艾叶燃烧装置见图1。燃烧塔上倒扣玻璃漏斗，由橡胶管连接2支U型管，玻璃漏斗与U型管中装DPPH溶液或无水甲醇，后与循环水真空泵相连。
　　2.3测试样品的制备
　　称取干燥的艾绒试样，卷成长条状，置于燃烧塔中，将其点燃，使其暗火燃烧，形成白烟，盖上玻璃漏斗，然后打开真空泵，使艾灸燃烟通人U型管中，2支U型管中有稳定的气泡冒出。
　　将艾叶燃烧产生的燃烟完全通人2支U型管中，每支U型管中装有浓度为250,mol·L的DP-PH甲醇溶液11mL，吸收完成后合并2支U型管试液至100mL的量筒内，加无水甲醇至44mL，再将其稀释1倍后作为样品1。而将艾叶燃烧产生的艾灸燃烟完全通人2支U型管中，每支U型管中装有无水甲醇11mL，吸收完成后合并2支U型管试液至100mL的量筒内，放置2d后，加人浓度为500,mol}L的DPPH溶液11mL后，加无水甲醇至44mL，反应20min后，将其稀释1倍，静置55min作为样品2.
　　2.4DPPH测量波长的确定利用紫外/可见分光光度计，分别全波长扫描无水甲醇,DPPH溶液、吸收艾灸燃烟后的甲醇溶液，确定最佳测定波长。无水甲醇的全波长的扫描以空气为空白，其他两溶液用无水甲醇作空白。DPPH扫描溶液的浓度为62.5N.,mol·L，艾灸燃烟为0.25g艾叶燃烧产生的量。
　　2.5 DPPH标准曲线的绘制精密量取1.0,1.5,2.0mL和3.0mL浓度为500,mol·L的DPPH溶液于5个10mL量瓶中，用无水甲醇定容至刻度。55min后以无水甲醇为空白，在516nm处测定吸光度A.
　　2.6稳定性试验稳定性实验是研究DPPH自由
　　基测定体系在艾灸燃烟作用下吸光度(A)随时间(t)的变化规律。分别测定样品1、样品2在波长516nm处的吸光度随时间的变化。
　　2.7艾灸燃烟与DPPH自由基反应按“2.3”项下制备样品1的方法，测定不同重量、不同贮存期艾叶燃烧产生的艾灸燃烟与DPPH直接作用的吸光度变化。
　　2.8艾灸燃烟稳定化合物与DPPH自由基的反应按“2.3”项下制备样品2的方法，测定0.1g艾灸燃烟中稳定物质与DPPH作用的吸光度变化。
　　2.9DPPH清除率的计算I)PPH自由基清除率I=(1一A;/A})x100%，其中A;为通人艾灸燃烟后DPPH的吸光度;A。为未通人艾灸燃烟的DPPH溶液的吸光度。
　　2.10半数清除率(1Cso)的计算抗氧化剂清除自由基能力采用清除DPPII的半数清除率(ICso)表示。ICs。为50%时所需样品的量，以样品的量对自由基清除率作图并进行线性拟合，计算1G5。值(这里指清除率为50%时所需艾叶的克数)。
　　2.11抗坏血酸对DPPH自由基清除率的测定以蒸馏水为溶剂，将抗坏血酸配制成浓度为I.仪2.0,4.0,6.0,8.0,10.0mg·mL溶液，分别精确量取不同浓度的抗坏血酸50},L至装有11mL浓度为500N.,mol·L的DPPH溶液中，在暗环境中反应55min后，稀释3倍测定其吸光度。
　　3结果与讨论
　　3.1DPPH反应体系的紫外吸收光谱及测足波长的确定按“2.4”项下方法对DPPH甲醇溶液、无水甲醇、艾灸燃烟的甲醇吸收液分别进行紫外吸收全波长扫描，如图2所示，DPPH溶液在516nm处出现特征吸收峰，而吸收艾灸燃烟后的甲醇溶液和无水甲醇在350一800nm处没有吸收峰，说明其不会对反应测定造成干扰。所以选516nm为测定波长。
　　3.2DPPH标准曲线按“2.5”项下方法测定DP-PH标准工作曲线。DPPH浓度在25一150N.,mo1·L-‘范围内线性关系良好。其回归方程为:
　　Y=0.0108X一0.0004
　　本实验最后使用62.5 r=1.000,A,mol·L测定其吸光度。
　　3.3稳定性按“2.6”项下条件分别测定样品1,样品2与DPPH反应其吸光度随时间的变化。从图3可以看出:所有样品1的吸光度在最初10min内下降较快;在10min后吸光度变化缓慢;50min后吸光度基本保持不变，0.20g和0.25g艾灸燃烟在20min左右时吸光度已经保持不变了，提示反应已经达到饱和。从实验的稳定性和可操作性角度，测定时选择DPPH与艾灸燃烟反应时间为55min。从图4可以看出，样品2在与DPPH反应20min后测量其吸光度，吸收值降低较慢，在55min后基本保持不变，所以测定艾灸燃烟稳定物质与DPPH反应时间为55min.
　　3.4不同贮存期艾灸燃烟活性自由基相对含量根据“3.1","3.3”项选定的测定波长和反应时间，分别测定0.1g质量的1,3和5年的艾灸燃烟和艾灸燃烟稳定化合物对DPPH自由基清除率，获得艾灸燃烟自由基浓度信息，并对不同贮存期艾灸燃烟自由基浓度进行对比评价。从图5可以看出艾灸燃烟清除DPPH作用明显强于艾灸燃烟中稳定化合物，差值应为艾灸燃烟活性自由基的贡献。从图6看出不同贮存期艾灸燃烟对DPPH清除率的差值分别为:1年32.09%,3年24.21%,5年20.55%。其中1年艾叶的相差值最大，3年略大于5年，说明不同贮存期艾灸燃烟中活性自由基浓度递减。
　　3.5艾灸燃烟、抗坏血酸对DPPH作用的比较图7一A为不同贮存期不同重量艾灸燃烟对DPPH清除率，0.OS一0.15g艾灸燃烟清除DPPH作用不断增强，随着艾叶质量的增加，3种贮存期艾灸燃烟的清除率慢慢接近，在0.15}0.25g范围内的清除率相近，这是由于艾灸燃烟与DPPH反应的浓度达到饱和。1年、3年和5年艾灸燃烟的ICS。分别为0.093,0.094和0.101g。图7一B显示抗坏血酸对DPPH自由基的清除率，可算出其ICSQ为4.22mgmL，由于抗坏血酸是量取50},L，所以相当于0.211mg的抗坏血酸的清除DPPH作用与1,3和5年艾绒的0.093,0.094和0.101g作用相当。
　　4结论
　　在艾灸燃烟中存在稳定的化学成分与活性自由基两类物质，都能清除DPPH自由基。由于自由基半衰期短，通过甲醇吸收并放置2d后，艾灸燃烟中活性自由基基本上碎灭，所以参加反应的基本上是艾灸燃烟中稳定物质，通过比较两者对DPPH自由基的清除率，可以得出艾灸燃烟中存在大量自由基的结论，并且不同贮藏期的艾灸燃烟中自由基相对含量不同，1年的艾灸燃烟自由基最多，3年与5年的产生的自由基相当。由于自由基对机体的伤害，所以自由基越多，艾灸安全性就越低，可以解释为什么“忧七年之病，求三年之艾”。
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