DNA疫苗的不同构象在体内外表达差异研究

　　DNA疫苗是20世纪90年代初从基因治疗领域发展起来的一种全新免疫制剂。随着人们对核酸疫苗的研究日益深人，也逐渐发现了其诸多优点，例如可诱导机体产生细胞和体液免疫应答;在细胞内产生抗原多肤，以天然的构象递呈给免疫识别系统，更接近于自然感染;不同的核酸疫苗具有共同的理化性质，为联合免疫提供了可能等川。目前，在DNA疫苗的制备中，会产生不同的质粒形式，如超螺旋、开环线性、闭环切刻、DNA多联体等，其中超螺旋质粒是最紧凑的结构，也是期望达到免疫效果最佳的拓扑结构。由于生产纯化工艺、周期等方面的差异，产生DNA质粒的超螺旋比例会有明显差异，这样就会对DNA疫苗的表达效率产生影响，所以建立有效的质量控制标准是很必要的。目前，我国研发的HIV疫苗的主要形式是DNA疫苗或病毒载体疫苗，但申报或即将申报的疫苗检测项目中其方法和质量标准均不统一，尤其对质粒构象标准也不统一，因此，有必要对不同构象DNA疫苗的表达差异进行分析评价，建立有效的DNA疫苗构象标准。
　　增强绿色荧光蛋白(EGFP)作为一种报告分子在监测目的基因的表达方面有着广泛的应用。同时，活体成像技术因其操作简单、所得结果直观、灵敏度高等特点也广泛应用于医药科学领域[6-91。它主要是将含有萤火虫荧光素酶基因的质粒接种动物，通过活体成像仪检测细胞内产生的荧光素酶蛋白。本研究利用上述2个具有报告基因特性的质粒(pcDNA3.1一EGFP和pDRVISVl.0一Fluc)来分别模拟DNA疫苗，通过3种处理手段(新鲜制备、反复冻融、酶切)以构建不同构象形式的质粒，来研究不同超螺旋比例的DNA疫苗在体内外表达量的差异，从而为DNA疫苗特别是艾滋病疫苗临床前研究的质量控制标准提供实验依据。
　　1材料和方法
　　1.1质粒、细菌及细胞报告质粒pcDNA3.1-EGFP(以下简称pEGFP)和pDRVISVl.0一Fluc(以下简称pFLUC)为中国食品药品检定研究院卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室(简称本室)构建;pDRVISVl.0质粒由NationalCancerInstitut。的JohnT.Schill教授惠赠。大肠杆菌DHSa由本室保存。293FT细胞由本室保存。
　　1.2试剂限制性内切酶Bgl]I,HindIII(NEB公司);切刻酶Nt.AlwI,Nb.BsmI(NEB公司);质粒大提试剂(QIAGEN公司);DMEM(GIBCO公司);FBS(GIBCO公司);转染试剂LipofectamineT}2000(Invitrogen);麻醉剂(戊巴比妥钠);荧光素酶底物(Xenogen一Calip公司);1kbDNAladder(NEB公司)1.3活体成像用动物雌性BALB/c小鼠，SPF级，6-8周，16-18g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号:SCXK(京)2007一0001。
　　1.4多种构象形式质粒的制备为了模拟DNA疫苗中存在的多种构象形式，将质粒pEGFP和pFluc分别使用质粒大提试剂盒提取，然后通过下列不同处理手段得到不同处理组的质粒:1.新鲜制备未冻存(pEGFP一N,pFLUC一N);11一70℃和37℃反复冻融处理7次(pEGFP一thaw,pFLUC一thaw);111.用限制性内切酶BglII,HindIII酶切使之成线性质粒(pEGFP一Bgl,pFLUC一Hind);1V.用切刻酶Nt.AlwI或Nb.BsmI酶切使双链DNA的一条链断裂使之成闭环切刻(pEGFP一Nt,pFLUC一Nb)。10}o琼脂糖凝胶电泳后，用凝胶成像仪观察分析各处理组质粒条带情况。
　　1.5pEGFP质粒转染293FT细胞及EGFP表达的检测将不同处理组的质粒(pEGFP一N,pEGFP一Bgl,pEGFP一Nt,pEGFP一thaw)采用Lipofectamine2000转染293FT细胞，每个处理组设2个重复孔，操作按照说明书进行，设阴性细胞对照。转染48h的细胞，用PBS洗2次，胰酶消化收集细胞，离心(1000一2000:·min一')5min,PBS洗2次，重新悬浮后，用200目筛网过滤，使用流式细胞仪(美国BD公司、FACSCaIi-bur)检测(激发光488nm，接收光530nm)EGFP的表达，用Cellquest软件进行数据获取与分析。
　　每1个样品收集1x104个细胞，根据细胞大小设定1个单细胞区域(gatedregion)，该区域的细胞用于荧光分析。以未转染的细胞作为阴性对照，调节各参数，设定EGFP阳性细胞区为M2，使阴性细胞在M2区的细胞数不超过0.1%(图2),FCM分析结果用细胞转染率和荧光指数(FI)表示。
　　转染率即EGFP阳性细胞阳性率，值越大，其转染效率越高;FI主要反映目的蛋白的表达效率，FI值越大，蛋白的表达效率越高，分别用下列公式计算:
　　转染率=样品M2区细胞百分率一阴性对照M2区细胞百分率FI二样品M2区细胞百分率x样品M2区平均荧光强度一阴性对照M2区细胞百分率x阴性对照M2区平均荧光强度
　　1.6pFluc质粒免疫BALB/c小鼠及luciferase表达的检测将不同处理组的质粒(pFLUC-N,pFLUC一Hind,pFLUC一Nb,pFLUC一thaw)接种BALB/c小鼠，每组平行接种5只小鼠。接种途径选择左右后腿胫前肌各半剂量(50p,g)接种。持续观察接种后28d的体内luciferase蛋白的表达。每次检测前15min腹腔麻醉小鼠，同时，腹腔注射1u-ciferase底物。15min后，将小鼠仰面放人Xenogen小动物体内可见光成像系统(lvls)检测小鼠体内荧光素酶的表达情况。
　　2结果
　　2.1不同处理组质粒的琼脂糖电泳结果质粒pEGFP的各处理组在1%琼脂糖凝胶电泳上的条带大小约分布在3kb一9kb，其中质粒pEG-FP一N电泳显示超螺旋构象为主要形式，定量分析比例大于99%，其有2条主要条带，1条大小约3.5kb，另1条为二聚体大小约为7kb;质粒pEGFP-thaw组条带分布及比例与pEGFP一N组相似，超螺旋比例大于99%;线性质粒pEGFP一Bgl组大小约6kb，与质粒理论值6.15kb一致;质粒pEGFP一Nt组电泳显示约8kb的条带为闭环切刻构象，定量分析显示所占比例大于80%(图1一A)o质粒pFLUC的各处理组在1%琼脂糖凝胶电泳上的条带大小约分布在4kb一9kb，其中质粒pFLUC一N组显示超螺旋构象比例大于90%，单体大小约4.5kb，二聚体大小约9kb;质粒pFLUC-thaw组条带情况与pFLUC一N组相似，超螺旋比例大于90%;线性质粒pFLUC一Hind组大小约6.6kb，与理论值6.6kb一致。质粒pFLUC一N组电泳显示约9kb的条带为闭环切刻构象，定量分析显示所占比例大于80%(图1一B)。故上述各处理组能满足实验所需要的不同的构象形式。
　　2.2流式细胞术检测pEGFP转染293F'1'后的表达结果采用流式细胞仪检测pEGFP转染293FT细胞48h后的表达情况，结果显示转染48h后，各处理组质粒的转染率和荧光指数(FI)有差异，pEGFP一N组最好，依次为pEGFP一thaw,pEGFP一Nt和pEGFP-Bgl。根据结果可以看出:质粒的超螺旋比例高时，其转染效率和表达水平都很高，而线性结构的质粒其转染效率和表达水平则明显降低(图2,表1)02.3活体成像术检测pFLUC接种小鼠后的荧光
　　素酶表达结果采用小鼠活体成像技术持续观察小鼠免疫后28d的体内荧光素酶荧光信号强度情况，结果显示:免疫后0.2d观察到荧光，之后强度持续开始增强，至第Sd达到平台期，维持至18d。质粒各处理组的荧光强度组间有显著差异，组内差异无显著统计学意义，超螺旋构象质粒(pFLUC一N)表达效率最高，反复冻融处理(pFLUC一thaw对质粒表达影响不明显，但线性(pFLUC一Hind)和闭环切刻质粒(pFLUC一Nb)表达效率明显下降。
　　3讨论
　　近年来，随着DNA疫苗的关注度日益增加，包括HIV疫苗的研制也集中在DNA疫苗和载体疫苗上。研究者们意识到影响疫苗免疫应答水平的因素很多，其中疫苗用质粒的质量和产量是研究工作的核心部分。国际上包括我们国家都对DNA疫苗的产品质量及生产过程提出相关技术指导原则，其基本原则是“安全有效，质量可控”，指导原则中对DNA疫苗的构建、生产工艺、药理、毒理、生物分布、质量控制及检定都有要求。我国对疫苗用质粒的结构要求是“环状结构的重组质粒所占的比例在90%以上”，美国FDA要求超螺旋结构要在80%以上。从安全角度上，一般认为，DNA质粒的超螺旋构象形式是质粒的天然拓扑结构，进人体内时不易整合进基因组，从而更安全。同时，因为DNA质粒的超螺旋形式是最具有天然生物活性的结构，因此，它也是转染细胞的最佳质粒形式[2,12]，而且，因为转染效率的提高也会大大提高免疫后体内外源抗原蛋白的产量，更好地诱导机体产生体液和细胞免疫应答。
　　我国HIVDNA疫苗的质量控制目前尚无统一的标准，尤其是对质粒的结构要求方面。为了更好地对疫苗的临床前及临床试验进行评价，建立质粒结构方面的标准化是非常必要的，所以完善并明确质粒中不同拓扑构象对生物学特性的影响是质粒结构标准化的前提。本研究通过小鼠活体成像技术监测质粒不同构象形式各处理组的荧光素酶的发光情况，从体内途径证实了当质粒DNA中超螺旋形式的比例高时，目的蛋白表达量最高。同时，又利用流式细胞术的方法从体外途径分析了质粒的不同构象形式对表达的影响，此方法不仅能观察不同构象质粒的转染效率(转染率)，而且能分析它们的表达水平(FI),结果也得到了相同的结论，即质粒的超螺旋形式的转染效率最高，在细胞中的表达量最高。另外，本研究显示，新鲜制备的质粒DNA经过反复冻融处理其表达效率和表达量略有下降，故要求在核酸疫苗的保存过程中应尽量避免反复冻融。
　　同时又注意到虽然质粒DNA反复冻融对表达水平有所影响，但还是明显好过切刻和线性DNA,由此更提示超螺旋结构是最稳定、致密的构象，DNA疫苗如果以此种形式保存和运输更能保证疫苗的安全有效。所以在DNA疫苗生产中建立一套有效的方法来分离和纯化高质量的超螺旋构象质粒就显得至关重要了。
　　不过，近年也有争议指出，DNA疫苗在注射患者的过程中其超螺旋结构可能被切割成线性或松弛型结构(如闭环切刻)或者在从细胞表面进人到核内时被核酸酶作用成上述结构。这样，不论疫苗产品中超螺旋的比例有多高，在细胞核周围聚集的质粒形式都是线性或松弛型的。而且，文献还指出佐剂或呈递物质的允许加人，也许使质粒的形式不再是影响体内转染效率的关键了。
　　总之，质粒构象对于DNA疫苗免疫效果的作用还需进一步的研究。并且对于细胞摄取外源DNA机制的基础性研究也十分重要。这些机制的研究对于DNA疫苗的质量控制具有重要的意义。
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