双标多测法Ⅰ-双标线性校正技术用于色谱峰的定性

　　由于中药成分复杂，采用多指标含量测定法方能全面地进行质量评价，但所需对照品数量众多，既给法定对照品的供应带来了困难，又显著提高了检测成本，限制了该法在中药质量标准中的推广。有学者提出了替代对照品或一测多评等解决方案，这些方法多使用一个成分做参照物(ref-erence)，对多个目标物(target)成分进行测定，以相对校正因子法定量，相对保留时间法定性，形式简单，并节省了大量对照品，但定量和定性误差时有偏大，鉴于此，作者提出了“双标多测法”，使用1个定量对照品以相对校正因子法定量，再增加1个定性对照品采用双标线性校正法进行色谱峰定性，并以大黄及其制剂中5种游离葱醒的分析为例，探讨该法的可行性。结果表明，较之相对保留时间法，双标线性校正法显著提高了定性的准确度和色谱柱的适用性，应用前景良好。
　　1实验部分
　　1.1仪器与试剂
　　Waterse2695高效液相色谱仪(2998PDA检测器)、Waters2695高效液相色谱仪(2996PDA检测器)和Waters2695高效液相色谱仪(2487紫外检测器)，Agilent1100高效液相色谱仪(紫外检测器)，ShimadzuLC一2010AHT高效液相色谱仪(紫外检测器、，上述仪器简称为LC1至LCS;C,、色谱柱:　KromasilC18，SunfireC,s，AgilentTC一Cis，InertsilCis，HyperisilCla，VensilMPC,s，Shimadzu}PC,s，PhenomenlungC,s，AgilentHC一Cia，4gilentZorbaxSB一C，SupelcoDiscoveryC,s，ShiseidoMGC,s，Shi-seidoAQC,s,DikmaDiamondC,8，依次简称为Col1至Col14,Col2}Col4}Col6,Col7,Col8规格为4.6mmx150mmx5Nm，其余为4.6mmx250mmx5Nm。色谱仪和C,、色谱柱为随机选择，包括不同品牌的常见的型号。
　　对照品芦荟大黄素(批号110795一200806)、大黄酸(批号110757一200206)、大黄素(批号110756-200110)、大黄酚(批号110796-200716)、大黄素甲醚(批号110758一200912)及大黄(批号121249-201003)对照药材来自中国食品药品检定研究院，桅子金花丸和三黄片购自药店;甲醇、乙睛、磷酸(色谱纯，美国Fisher公司)，盐酸、甲醇、氯仿(分析纯，北京化工厂)，水由Milli一Q系统(美国Millipore公司)制备。
　　1.2色谱条件初始条件:流动相为甲醇-0.1%磷酸水溶液(85:15)，检测波长254nm，柱温30℃，流速1.0mL·min。对照品溶液进样量入4,8,10,20p,L，进样3次。改变条件并记录相应数据，参数见结果与讨论。
　　1.3对照品溶液制备取上述对照品适量，加甲醇制成每1mL含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚各16g，大黄素甲醚8g的溶液。
　　1.4供试品溶液制备取药粉(过四号筛)约0.15g，称重，置具塞锥形瓶中，加甲醇25mL，称重，回流1h，放冷后称重并补重，摇匀，滤过。取续滤液5mL置烧瓶中，挥干后加8%盐酸10mL超声2min,加氯仿10mL，回流1h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并人分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷萃取3次，每次10mL，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移并用甲醇定容至10mL量瓶中，摇匀，取续滤液，即得[13j。制剂照处方，折算与药材相同的当量，三黄片约0.2g,桅子金花丸约1g，按上述方法制备。
　　2结果与讨论
　　2.1定量研究
　　2.1.1定量原理及校正因子公式
　　色谱仪的紫外检测器可看作一台紫外一可见分光光度计，其瞬时响应值遵循Lambert一Beer定律，而峰面积是瞬时响应值对时间的积分，结合绝对校正因子公式f=W/A)，李聪导出了如下表达式:
　　(1)其中，W,A,M和E为待测物的质量、峰面积、相对分子质量和摩尔吸光系数，F为流动相流速，L为检测器光程长度，f为检测器输出单位。
　　将(1)式结合线性方程公式(A=kW})和相对校正因子定义，作者得出了替代对照品模式的定量公式:
　　(2)式表明，紫外检测器相对校正因子的本质
　　是两物质百分吸光系数的比值。这将色谱学概念简化为光谱学概念，前提是:色谱仪通过检定，即进样系统、输液系统、柱温箱、检测器等均保持一定的准确度和精密度。另据(2)式，k。与frt互为倒数，因线性方程使用更普遍，下文以k。代替rt进行分析。
　　2.1.2,相对校正因子的可变因素替代对照品模式的文献均考察不同色谱柱、流速、柱温和色谱仪对kn重现性的影响。但据(1),(2)式可知，理想状况下，这4个因素对k}}无影响，可在一定范围内变动;实际状况下，当色谱仪通过检定时，前3个因素主要反映了同一仪器产生的测定误差，因素4体现了不同仪器的差异，上述误差常小于3%nz，可以接受，本文结果证实了上述理论分析的结论，详见表1(以芦荟大黄素为参照物;色谱柱Col1一Col5，流速0.7,1.0,1.3mL·min，柱温20,30,40℃，色谱仪LC1一LCS，测定其中一个因素的瓦时，固定其他因素并选择该因素的中位值沪个因素kr，的均值为1.166,1.296,0.921,1.312。
　　2.1.3相对校正因子的不可变因素由(2)式可知，影响物质百分吸光系数的因素，如温度，溶剂和检测波长均会影响krt。温度，即检测池温度，柱温不高时即室温，为(25士5)0C，对百分吸光系数影响很小，一般不必考察(本文条件为25℃士5℃);柱温较高时，温度更接近柱温，建议考察。溶剂即流动相，本研究考察了流动相(A为甲醇,B为乙睛,C为0.1%磷酸水溶液)变化对相对校正因子的影响，见表2。由结果可知，流动相比例可适当调整，加人乙睛后，ka也基本不变。表3的波长考察结果显示，254nm士2n二时，RSD均小于3%，满足要求，波长范围再扩大，误差已很明显，说明检测波长是影响k。的关键因素，应限定12nm。汇总“2.1.2”和"2.1.3”中数据，以芦荟大黄素为参照物，得大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的均值为1.164,1.294,0.921和1.3060.
　　2定性研究
　　2.2.1定性原理对保留时间法是常用的色谱峰定性法，在欧美及中国药典中广泛用于有关物质检查，替代法研究中也多使用。但由于色谱仪与色谱柱的差异，保留时间的预测值与实测值之间的偏差常常较大，实际应用中需限定色谱柱的型号，或选择同类型、分离性能相似的色谱柱〔15-17，多有不便。王龙星等报道在不同色谱仪及Cls柱上，组分的保留时间存在线性关系;，这种关系可用于保留时间的预测。作者使用初始条件和5种葱醒在10个色谱系统(LC1一LCS,Col1一Col10)上进行实验，结果表明，该结论重现性良好。另发现，同一成分在10根柱上保留时间均值的拟合效果整体上优于任意实际色谱柱的实测值，因此，提出使用均值(称为标准保留时间，standardretentiontime，简称SRT)作为预测的基准值。图1即拟合结果，横坐标为5种葱醒的SRT,纵坐标为各色谱柱上的实测保留时间，各色谱柱的线性方程和相关系数见表4。由图1和表4可见，大黄素的保留时间在5根色谱柱上(Col1,Col3一Col6)与拟合直线稍有偏离，另见Col1,Col3柱直线的截距很大，明显偏离原点，说明成分在其上的相对保留时间与其余色谱柱有较大差异。考虑到多点线性校正无助于节省对照品，而两点决定一条直线，作者提出双标线性校正法，兼顾效率和成本。
　　2.2.2双标线性校正法的实施步骤
　　双标线性校正法的建立应提供所有成分的SRT作为保留时间预测的基准值，并明确双标成分。双标选择遵循和兼顾的一般原则为:(1)尽量分布在目标化合物保留时间段的两端，最优位置是将保留时间段均分成4段后，第一和第三2个分界点附近;(2)尽量不要选择在色谱柱拟合过程中偏离较大的成分;(3)尽量选择价廉易得的成分。本文的SRT为5种葱醒在Col1一Col10上的保留时间均值，依次为芦荟大黄素4.081min、大黄酸4.979min、大黄素7.380min、大黄酚9.385min和大黄素甲醚12.715min。双标选择保留时间最短的芦荟大黄素和最长的大黄素甲醚。双标线性校正法的使用步骤有3步，示意见图2。
　　首先，在未知Cis柱(以Col12为例)上运行双标对照品溶液和供试品溶液，通过对照品进行色谱峰定性从而获得双标成分在供试品中的实测保留时间:芦荟大黄素4.970min，大黄素甲醚16.000mino然后，以SRT为纵坐标，实测保留时间为横坐标，得到两点:芦荟大黄素(4.970,4.081)和大黄素甲醚(16.000,12.715)，进而得到两点线性方程:Y=0.7828X+0.1903。最后将其余3种蕙醒的SRT值(本文对应Y值)代人方程，得到预测保留时间:大黄酸6.117min、大黄素9.185min、大黄酚11.746min。实测保留时间依次为5.978,9.218,11.843min，偏差的绝对值依次为0.14,0.03,0.10min，预测效果良好。
　　2.2.3双标线性校正法与相对保留时间法预测效果的比较表5,6为2种保留时间预测方法在10根色谱柱上的比较结果(相对保留时间法的预测以大黄素为参照物，相对保留时间的均值为0.556,0.678,1.266和1.709，其中，表6第二列是预测保留时间与实测保留时间的最大绝对偏差;第三列是对应的最大相对偏差;第四列是绝对偏差小于等于0.5min的数目占总数的百分比;当某色谱柱L各成分预测值的绝对偏差都小于等于0.5min时，认为该柱适用，第五列为适用柱的总数;第六列和第七列为对应的相对偏差的百分比和适用柱数目。由结果可见，双标线性校正法的预测精度更高，适用的色谱柱数量更多，明显优于相对保留时间法。
　　改变色谱条件(改变流速、柱温和流动相，参见"2.1.2"，使用初始条件的SRT和相对保留时间进行预测(验证了2个色谱系统:LC1对应Col4和LCS对应Col2)，结果为:双标线性校正法的绝对偏差为0.027一0.657min，相对偏差0.44%一6.74%，绝对偏差小于0.5min的百分比为88.9%，相对偏差小于5%的为77.8%;相对保留时间法的值依次为0.011一2.673min,0.16%一17.14%,77.1%和58.3%，双标线性校正法仍优于相对保留时间法。
　　2.3样品分析
　　用4根新C,8柱，在初始条件下分析大黄、桅子金花丸和三黄片，图3为Col11的对应色谱图。结果表明，双标线性校正法或相对保留时间法均可较好地预测成分在Col11和Col12上的保留时间，但Col13和Col14误差均偏大;表7数据显示双标线性校正法精度仍明显优于相对保留时间法;不同的品种可使用一个色谱条件分析，通过色谱峰轮廓的不同进行分辨。
　　3结论
　　本文提出了一种新的替代对照品模式的多指标含量测定法—双标多测法。定量方面，对相对校正因子的理论公式和影响因素进行了探讨，明确了检测波长为关键因素;定性方面，提出了双标线性校正法，在试验的14根色谱柱中，该法可用于Col2一Col5,Col7一Col12共10根色谱柱，相对保留时间法仅能用于Co12,Co15,Co17,Co19,Co11I和Col12，且该法预测精度更高，允许色谱条件在一定范围内变动;建立了大黄及制剂中5种葱酿的替代分析法。双标多测法增加了1个对照品，但仅用于定性，用量少，可使用鉴别对照品，不会显著提高方法的运行成本。
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