不同来源决明子的质量分析

　　决明子为豆科一年生草本植物决明Cassiaob-tus如LiaL.或小决明CassiatoraL.的干燥成熟种子。生于村边、路旁和旷野等处，分布于长江以南各省区，南北各地均有栽培。决明子人药最早记载于我国的《神农本草经》，列人120种上药(“为君主养命以应天”)之一，以明目之功而名，性味甘、苦、咸、微寒、无毒，归肝、’肾、大肠经}3J，在临床上应用广泛。决明子主要含有惠醒类、氨基酸类、微量元素及蔡并毗喃酮类化合物四类成分。葱醒类化合物是决明子的主要有效成分之一，主要为大黄酚、大黄素甲醚、决明素、橙黄决明素等。决明子质量参差不齐，为更好地控制药材质量，本实验采用中国药典及自行建立的方法对不同产地2种来源的决明子进行检测分析，以比较两者之间的差异，为制定决明子对照药材及相关中药制剂质量控制标准提供参考依据。
　　1仪器与试药
　　TI,CLINOMAT薄层自动点样仪;Waters1525高效液相色谱仪(2996PAD检测器，Em-power色谱工作站);CG一300超声清洗仪(功率300W，频率25kHz);AE240电子分析天平;国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2.0版)。
　　对照品大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、大黄酸、芦荟大黄素(供含量测定用，批号依次为110756-200110、110796一200716、110758一200611、110757-200206,110795一200806);橙黄决明素对照品(实验室自制，I-IPLC法测得纯度为98070);对照药材决明(供鉴别用，批号121011一200604和小决明(供鉴别用，批号121544一200501，均购自中国食品药品检定研究院。
　　甲醇、乙睛为色谱纯，重蒸水。其他试剂均为分析纯。Merck高效薄层层析板(100mmx100mm，玻璃板)由Merck公司生产，批号:105642二药材:13批次决明子药材分别产自河北、河南、广西、湖南等地。经湖南省食品药品检验研究院丁野副主任药师鉴定，为豆科植物决明Cassiaobtus如-liaL.或小决明CassiatornI.的干燥成熟种子，样品信息见表1.
　　2薄层色谱鉴别
　　2.1取本品粉末0.5g，加甲醇20mL，超声(}O}Y25kHz)处理15min，滤过，滤液浓缩至约1mL，作为供试品溶液。另取决明对照药材、小决明对照药材各0.5g，分别同法制成对照药材溶液。再取大黄酚对照品及大黄素甲醚对照品，加甲醇制成每1mL中各含1mg的混合溶液，作为对照品溶液。吸取上述供试品溶液、对照药材溶液、对照品溶液各5L，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(30一60℃)-甲酸乙醋一甲酸(15:5:1)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。可见2种来源的决明子的斑点基本一致.结果见图1.
　　2.2取本品粉末1g，加甲醇10mL,浸渍1h,滤过，滤液蒸干，残渣加水10mL使溶解，再加盐酸1mL，置水浴上加热30mirz，立即冷却，用乙醚振摇提取2次，每次20mL，合并乙醚液，蒸干，残渣加乙酸乙醋1m工使溶解.作为供试品溶液。另取决明、小决明对照药材各0.59，分别同法制成对照药材溶液。再取橙黄决明素对照品及大黄酚对照品，加无水乙醇一乙酸乙醋(2:1)制成每1mL中各含1rng的溶液，作为对照品溶液)吸取_L述供试品溶液、对照药材溶液、对照品溶液各2,L，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油(30}600C)一丙酮为展开剂，展开，取出，晾干，置氨蒸气中熏后检视。可见2种来源的决明子的斑点基本一致，结果见图2.
　　3特征图谱
　　3.1HPLC色谱条件色谱柱ZorbaxSBC,8(250mmx4.6mm,5,t,m);柱温35℃;流速0.8mL·min:波长270nm;流动相乙睛(A)一0.1%磷酸溶液(B)二元梯度洗脱0一20min(20%A->32%A)，20一50min(32%A),50一70min(32%A-X53%A)，70一8Smin(32%A-->53%)，85一86min(53%A90%A),86一90min(90%A)。
　　3.2参照物溶液的制备取橙黄决明素对照品适量，精密称定，加无水乙醇一乙酸乙醋(2:1)混合溶液制成每1mL含橙黄决明素20O,g的溶液，即得。
　　3.3供试品溶液的制备取本品粉末(过三号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，置水浴上加热回流30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25mL,蒸干，加稀盐酸30mL，置水浴中加热水解1h，立即冷却，用三氯甲烷振摇提取4次，每次30mL，合并三氯甲烷液，回收溶剂至干，残渣用无水乙醇一乙酸乙溶解，转移至10mL量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得3.4方法学考察3.4.1精密度试验精密吸取同一份供试品溶液(样品编号9)，进样6次，每次5},L，以橙黄决明素为参照峰，对主要色谱峰的相对保留时间及相对峰面积进行统计，RSD均低于3.0%。结果表明精密度良好。
　　}.4.2稳定性试验取同一份供试品溶液(样品编号9)，分别于配制后的氏歇16,24,4$h，精密吸取5}L，注人液相色谱仪，测定。以橙黄决明素为参照峰，对主要色谱峰的相对保留时间及相对峰面积进行统计，RSD均低于3.0%。结果表明:供试品溶液在配制后48h内基本稳定。
　　3.4.3重复性试验取同一批号样品(样品编号9)依法制备5份供试品溶液，测定并计算，对主要色谱峰的相对保留时间及相对峰面积进行统计，RSD均低于3.0%。结果表明本方法重复性较好。
　　3.4.4色谱图谱的完整性按上述色谱条件，梯度运行后，保持最后的流动相比例乙睛-0.1%磷酸溶液继续采集色谱图至200min,100min后未检出色谱峰，说明在此条件下的可检测到的药材中的成分在100min内已全部流出。
　　3.5评定标准决明子特征图谱中应有4个特征峰，与参照物(橙黄决明素)峰相应的峰为5峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的+5%之内。规定值为1.374(峰1),l.882峰2),L927(峰9}。采用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2.0版)对不同来源的13批决明子样品进行了相似度评价，编号为2,9,11,12,13号样品的相似度均低于0.9，结果表明不同来源的决明子药材的色谱图基本一致，但各批次样品色谱峰所代表的化学成分量存在一定差异。
　　4小结与讨论
　　4.1经现阶段研究实验中采用的薄层色谱鉴别结果显示，不同产地2种来源的决明子所含成分的种类基本一致，无显著差异。
　　4.2特征图谱研究中流动相的选择针对决明子的有效成分主要是葱醒类，主要考察了甲醇一磷酸及乙睛一磷酸系统作为流动相在不同梯度洗脱下的色谱图，以乙睛一磷酸系统分离效果最佳。
　　4.3特征图谱研究中检测波长的选择从各组分的紫外吸收波长检测结果可知，葱醒类均在270nm附近有较大吸收，故测定波长选择270nmo4.4共试验了3种不同品牌的色谱柱，从中选用了ZorbaxSBC,}(250mmx4.6mmx5N.,m)，该色谱柱分离效果好，且pH适应范围在0.8一8.0之间，耐酸性强，较为适合酸性系统。
　　4.5经比较所有测定和记录的色谱图，在观察众多样品色谱图后，确定决明子的4个峰作为特征峰组成其特征图谱。通过对照品定位实验，考察对照品的保留时间及紫外光谱，鉴别了决明子药材HPLC特征图谱中5,2,33个色谱峰，分别为橙黄决明素、大黄酚、大黄素甲醚，因橙黄决明素为决明子的特征性成分，且相对保留时间居中，故选择橙黄决明素作为参照物。
　　4.6由表2可知，编号为2,9,11,12,13号样品与对照指纹图谱比较，其相似度均低于0.9(5种样品并非为同一来源)。因8号样品与对照指纹图谱相似度最大(0.989，故选取8号样品作为对照，选出10个主要色谱峰，计算其余样品色谱峰与8号样品色谱峰的相对峰面积。通过比较可知:2号、12号样品色谱峰缺失严重(前者4个，后者5个),9号、11号、13号样品色谱峰相对8号样品对应色谱峰相对峰面积波动范围较大。经比较样品信息，相似度小于0.9与其产地无关，具体原因需进一步研究。
　　4.7本项研究按中国药典2010年版一部“决明
　　子”的质量标准对收集到的13批样品进行了考察，结果表明13批样品除部分样品的总灰分检查及含量测定结果不符合规定外，其余项目均符合规定。
　　在中国药典2010年版一部“决明子”质量标准的基础之上，针对决明子所含的化学成分，增加了1个薄层色谱鉴别项及特征图谱检查项，增加了杂质及酸不溶性灰分检查项，完善了总灰分的限度标准，并对2种来源的决明子(决明及小决明)的薄层色谱行为、特征图谱及含量测定结果进行了比较，试验结果表明2种来源的决明子在薄层色谱行为及特征图谱及主要成分的含量上，无明显区别，故建议决明子对照药材采用共列方式收载，合并发放。在上述试验结果基础之上，建立了决明子对照药材标定技术标准及筛选出了一批备选原料，并对备选原料进行了验证，结果符合规定。
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