阿瑞匹坦中有关物质检查方法的研究

　　阿瑞匹坦(aprepitant,5一「[(2R,3s)一2-[(1R)一1一「3,5-二(三氟甲基)苯基〕乙氧基]-3一(4一氟苯基)-4一吗琳基一〕甲基〕-1,2-二氢-3H-1,2,4一三氮哇-3一酮，图1)，是由默克公司研制的，被FDA批准上市的第1个神经激肤-1(NKl)受体拮抗剂，适应症为预防化疗引起的急性和延迟性恶心、呕吐。阿瑞匹坦含3个手性中心，有8种立体异构体，可分成4组，其构型分别为RRS和ssR,RSs和SRR,SRS和RSR,RRR和SSS。每组中的2个异构体互为对映异构体，组与组之间的异构体互为非对映异构体[27。本文中分别用RSS异构体、SRS异构体和RRR异构体代表其他3组非对映异构体。USI}书采用梯度洗脱的方法对阿瑞匹坦进行有关物质检查，其流动相中含有离子对试剂，进行梯度洗脱时，平衡慢，重复性差，不能直接与质谱仪联用。有关于测定阿瑞匹坦在人或动物血浆了、制剂[6」中含量的文献，但不适用于测定阿瑞匹坦原料药中的有关物质。SigalaAshok}':报道了分离阿瑞匹坦原料药中有关物质的方法，流动相含有磷酸二氢钾缓冲液，方法繁琐，且其只分离了一种工艺杂质(为本文中的中间体1)和3个非对映异构体。本文参考文献「s7，建立了一种高效液相色谱法测定阿瑞匹坦中的有关物质，在选定的色谱条件下，阿瑞匹坦的合成起始物、中间体、异构体和反应副产物等8种物质均能得到良好分离，对杂质的检查方法进行了验证，均符合要求。本文方法简便、专属、准确，适用于阿瑞匹坦原料药中的有关物质检查，且流动相中不含非挥发性成分，适用于LC一MS分析。该方法未见文献报道。-1,2一二氢-3H一1,2,4一三氮哇-3一酮)均由四川大学华西药学院吴勇教授提供，结构见图20乙睛，HPLC级，Sigma一Aldrich公司;三氟乙酸，HPLC级，天津市科密欧化学有限公司;水为乐百氏纯净水;其他试剂均为分析纯。
　　1仪器与试药
　　日本岛津LC一lOAT型高效液相色谱仪，SPD-lOAvp紫外检测器，SPD一M10Avp二极管阵列检测器。起始物1(4一节基一2一轻基吗琳一3一酮)、起始物2[(R)一1一(3,5一二(三氟甲基)苯基)乙醇〕、中间体1[(2R,3S)一2一「(1R)一1一[3,5-双(三氟甲基)苯基」乙氧基〕一3一(4一氟苯基)-吗琳〕、中间体2((E)一甲基一2一[1一氨基一2-[(2R,3S)-2一[(R)一1一[3,5一二(三氟甲基)苯基〕乙氧基一3一(4一氟苯基)吗琳基〕亚乙基〕甲酸脐甲醋)、脱氟阿瑞匹坦(5一〔[(2R,3R)一2-[(1R)一1一[3,5一二(三氟甲基)苯基]乙氧基〕-3一苯基一4一吗啦基一〕甲基口-1,2一二氢-3H-1,2,4一三氮噢-3一酮基)、SRS异构体(5-[[(2R,3S)一2一[(1S)一1一〔3,5一二(三氟甲基)苯基〕乙氧基〕-3一(4一氟苯基)-4一吗啦基一〕甲基〕-1,2一二氢-3H一1,2,4一三氮哩-3-　酮),RRR异构体(5一「[(2R,3R)一2一[(1R)-1一「3,5一二(三氟甲基)苯基〕乙氧基〕一3一(4-氟苯基)-4一吗琳基一」甲基〕-1,2一二氢-3H-1,2,4一三氮噢一3一酮)、RSS异构体(5一[[(2S,3S)一2一仁(1R)一1一[3,5一二(三氟甲基)苯基〕乙氧基1-3一(4-氟苯基)-4一吗琳基一〕甲基〕.
　　2方法与结果
　　2.1色谱条件的选择
　　2.1.1色谱柱的选择试验了Cia柱，在乙睛一水一三氟乙酸系统中分离阿瑞匹坦粗品，结果各杂质分离良好，但RSS异构体保留强，在约56min出峰;试验了Ca柱，结果RSS异构体的出峰时间缩短，其余各杂质分离情况与C,:柱类似。故选择Ca柱。
　　2.1.2三氟乙酸和乙睛比例的选择考察了流动相中三氟乙酸比例为0.04%,0.O5%,0.06%时，对各杂质保留时间的影响。其中，中间体1、中间体2随着三氟乙酸比例的增加，保留增强;阿瑞匹坦、脱氟阿瑞匹坦、SRS异构体随着三氟乙酸比例的增加，保留减弱;起始物1、起始物2,RRR异构体、RSS异构体对三氟乙酸的变化不敏感，保留时间几乎不变。确定三氟乙酸含量为0.05%，此时分离效果最佳。
　　考察了流动相中乙睛比例为48%,50%,52%时，对各杂质的分离的影响。综合考虑分离效果和操作的简便性，确定乙睛含量为50%。最终确定流动相为乙睛一水一三氟乙酸(50:50:0.05)，此时，各杂质均能良好分离。
　　2.1.3波长的选择将样品及杂质对照品用DAD检测器扫描，结果表明，阿瑞匹坦和多数杂质在200nm,260nm的波长处有最大吸收，在215nm均有较强吸收，综合考虑各成分的吸收强度和基线的稳定性等因素，选择215nm作为检测波长。
　　2.1.4溶剂的选择考察了分别用流动相、乙睛-水(1:1)为溶剂时阿瑞匹坦在8h内的稳定性。结果表明，使用乙睛一水(1:1)作溶剂时，阿瑞匹坦在8h内稳定;用流动相作溶剂时，阿瑞P}坦在8h内新增2个杂质(tR=3.7min和tR=4.1min)。故选择乙睛一水(1:1)作为阿瑞匹坦有关物质检查的溶剂。
　　2.1.5进样量的考察配制浓度为2mg"mL的供试品溶液，分别取5,10,15,20},L进样分析。结果表明，进样量为10},L时，检出的有关物质个数不再增加，故进样量确定为20},g，制备供试品溶液浓度为1mg·mL，进样量为20,L.
　　2.2色谱条件
　　色谱柱:InertsilC8柱(150mmx4.6mm,5tm)，流动相:乙睛一水一三氟乙酸(50:500.OS)，流速:1.0mL·min，检测波长:215nm，柱温:30℃，进样量:20L.
　　2.3测定方法采用不加校正因子的主成分自身对照法对阿瑞匹坦原料药中的有关物质进行检查。选择与主成分相邻的SRS异构体制成系统适用性试验溶液，以考察其分离度是否符合要求。具体方法如下:取本品适量，精密称定，加乙睛一水(l:l)溶解并稀释制成每1mL中约含1mg的溶液，作为供试品溶液;精密量取适量，用乙睛一水(l:l)定量稀释制成每1mL中约含S},g的溶液，作为对照溶液;另精密称取阿瑞匹坦对照品和SRS异构体各适量，用乙睛一水(1:1)溶解并定量稀释制成每1mL中约含阿瑞匹坦1mg和SRS异构体0.OSmg的溶液，作为系统适用性试验溶液。照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录VD)试验，用辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以乙睛一水一三氟乙酸(S0:50:0.O5)为流动相;检测波长为215nm。取系统适用性试验溶液20},L，注人液相色谱仪，记录色谱图，阿瑞匹坦与SRS异构体的分离度应大于2.0。取对照溶液20L，注人液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的20%，精密量取供试品溶液和对照溶液各20},L，分别注人液相色谱仪，记录色谱图至主成分色谱峰保留时间的4倍。
　　供试品溶液的色谱图中如有杂质峰，单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.2倍(0.1%)，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液的主峰面积　　(0.5%)。
　　2.4 方法的验证
　　2.4.1专属性
　　分别吸取空白溶剂、供试品溶液、起始物1、起始物2,中间体1、中间体2,SRS异构体、RRR异构体、RSS异构体对照品溶液及其混合溶液20L，注人液相色谱仪，记录色谱图，结果见图3。由图可知，溶剂对有关物质检查无干扰，各成分之间能良好分离，本法专属性良好。系统适用性试验溶液:取阿瑞匹坦对照品和sRs异构体各适量，配制成每1mL中约含阿瑞匹坦1mg和SRS异构体0.OSmg的溶液，作为系统适用性试验溶液。取20},L，注人液相色谱仪，记录色谱图，要求阿瑞匹坦和SRS异构体之间的分离度应大于2.0，结果见图4.
　　2.4.2检测限分别取阿瑞匹坦和起始物1、起始物2、中间体1、中间体2、脱氟阿瑞匹坦、SRS异构体、RRR异构体、RSS异构体对照品溶液，按不同的比例稀释后混合进样，按信噪比为3:1(SlN二3)测定其检测限，结果其检测限分别为0.10,0.74,0.50,0.48,0.49,0.50,1.79,0.93ng}
　　2.4.3线性和范围
　　取阿瑞匹坦对照品适量，配制成含阿瑞匹坦浓度为1g·mL,10g·mL-’溶液，分别吸取2n}L(1wg·mL,),1,2,10,20},L(10g·mL)进样测定，以峰面积(A)对相应的进样量(X)进行线性回归。
　　取起始物1，起始物2，中间体1，中间体2，脱氟阿瑞匹坦，SRS异构体，RRR异构体和RSS异构体适量，配制成含各杂质浓度为2},g·mL-‘的混合溶液，分别吸取1,2,5,10,15,20},L进样，分别以各杂质对照品的峰面积(A)对相应的浓度(X)进行线性回归。阿瑞匹坦及各杂质的回归方程、相关系数见表1。结果表明，阿瑞匹坦进样量在2}200ng的范围内，起始物1、起始物入中间体1、中间体入脱氟阿瑞匹坦、SRS异构体,RRR异构体和RSS异构体进样量在2}40ng范围内，峰面积与进样量呈良好的线性关系。
　　2.4.4进样精密度取阿瑞匹坦对照品适量，配制成浓度为5},g·mL的对照溶液;取阿瑞匹坦样品适量，加人各杂质混合溶液适量，配制成阿瑞匹坦浓度为1mg·mL-1、各杂质对照品浓度为1},g·mL的加样供试品溶液。取对照溶液和加样供试品溶液各20},L，连续进样5次，记录色谱图，按峰面积计算平均值和RSD，测得阿瑞匹坦，起始物1,起始物2、中间体卜中间体么脱氟阿瑞匹坦、SRS异构体、RRR异构体和RSS异构体的RSD分别为0.4%、0.4%、0.8%、0.9%、0.8%、1.0%、1.9%、0.9%,1.9%。结果表明对照溶液和加样供试品溶液的进样精密度良好。
　　2.4.5溶液的稳定性
　　取阿瑞匹坦样品适量，加乙睛一水(1:1)溶解并配制成浓度为1mg·mL的供试品溶液。取供试品溶液20},L，分别在同一日内。,2,4,6,8h进样分析，按峰面积归一化法测定杂质的含量，结果在8h内各杂质的含量均无变化，表明本法的日内精密度良好，供试品溶液在8h内稳定。
　　取阿瑞匹坦样品适量，加人各杂质混合溶液适
　　量，配制成阿瑞匹坦浓度为1mg·mL、各杂质对照品浓度为1g·mL的加样供试品溶液。取加样供试品溶液20},L，分别在同1d内0,2,4,6,8h进样分析，按峰面积计算平均值和RSD，测得起始物1、起始物2、中间体卜中间体么脱氟阿瑞匹坦、SRS异构体,RRR异构体和RSS异构体的RSD分别为0.7%、1.6%、1.4%、1.0%、].6%、1.5%、1.7%和1.7%。结果表明本法的日内精密度良好，加样供试品溶液在8h内稳定。
　　取以上加样供试品溶液20},L，分别在。,1,2,3d进样分析，按峰面积计算平均值和RSD，测得起始物1,起始物2,中间体1,中间体2、脱氟阿瑞匹坦、SRS异构体、RRR异构体和RSS异构体的RSD分别为0.9%、1.7%,0.7%、1.9%、1.6%、1.8%、1.0%和1.9%。结果表明本法的日间精密度良好，加样供试品溶液在3d内稳定。
　　2.4.6耐用性分别在InertsilC8(250mmx4.6mm,5m)、DiamonsilC8(2)(250mmx4.6mm，5}.A,m)和InertsilC8(150mmx4.6mm,5N,m)色谱柱上进行分析。经试验，在3根色谱柱上，阿瑞匹坦与各杂质均能完全分离，表明本法的耐用性良好。
　　2.5校正因子的测定为了解杂质与阿瑞匹坦检测信号的相对强度，测定了各起始物、中间体、反应副产物和异构体的校正因子。取各杂质对照品适量，配制成含阿瑞匹坦和各杂质对照品浓度分别为5,1,5,0.5},g·mL-‘的高低2种浓度的混合溶液，分别吸取20},L进样分析，连续进样3次。以阿瑞匹坦为参比，取6次进样计算的校正因子平均值，得起始物1、起始物几中间体七中间体2、脱氟阿瑞匹坦、SRS异构体,RRR异构体和RSS异构体的校正因子分别为0.5,1.21.5,1.1,0.9,0.9,1.0,0.9。校正因子的RSD均在3%以内。测得3批小试样品中含有已知杂质脱氟阿瑞匹坦，其校正因子在0.9一1.1的范围内，故采用不加校正因子的主成分自身对照法。
　　2.6样品中杂质的测定采用上述方法测定了3批阿瑞匹坦原料药的有关物质，结果见表2.
　　3讨论
　　3.1该有关物质检查方法可以同时控制阿瑞匹坦的工艺杂质和非对映异构体杂质，而阿瑞匹坦的对映体杂质采用手性柱在对映体杂质检查中控制。
　　3.2阿瑞匹坦经过酸解、碱解和氧化破坏产生了2个主要杂质，其中1个杂质与起始物2保留时间相同，初步确定其为起始物2。要进一步确认2个主要降解产物的结构，应用LC一TOF一MS,LC一MS-MS联用技术分析。
　　3.3对阿瑞匹坦小试样品进行试验，结果阿瑞匹坦中含有与脱氟阿瑞匹坦(杂质4)保留时间相同(6.1min的杂质，且在不同的色谱条件下，其保留时间均相同，应为同一种物质。
　　3.4该工艺路线中，有1个强保留的中间体，在本文色谱条件下约53min出峰。由于提供的3批小试样品中均不含该中间体，且破坏试验中也没有产生，为节约时间，操作方便，将记录时间定为主峰保留时间的4倍，即30min。曾试验过将等度改为梯度洗脱，但是由于本试验是在215nm的低波长处检测，基线容易波动，而且整个梯度程序也需要55min，故没有采用梯度洗脱。在本试验色谱条件下，基线平稳，可通过延长记录时间至主峰保留时间的8倍，来防止漏检。
　　3.5由于提供的杂质对照品中，中间体2、脱氟阿瑞匹坦、SRS异构体,RRR异构体、RSS异构体的纯度小于99%，在计算检测限和校正因子时，均按纯度进行了折算。
　　参考文献
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