建立马钱子散中士的宁含量的高效液相色谱测定方法

马钱子散是《中国药典》2010年一部收载品种，由马钱子、地龙组成，具有祛风湿，通经络的功能，用于风湿闭阻所致痹病的治疗[1]。方中马钱子为采用沙烫方法制成的炮制品，从而降低毒性成分士的宁的含量[2]，但士的宁同时又是马钱子的有效成分[3,4]，因此须规定本品中士的宁的含量限度，以保证本品的安全性和有效性。马钱子散中士的宁的含量测定方法最初是采用酸碱滴定的方法，之后耿万玲等建立了双波长薄层扫描法[5]，《中国药典》至2010年版仍采用薄层扫描法，然而薄层色谱法灵敏度较差，且实验条件要求严格。高效液相色谱法具有较高的灵敏度和重现性，但以往士的宁含量测定方法中多在流动相中加入价格昂贵的庚烷磺酸钠和磷酸缓冲盐[6,7]，使色谱洗脱步骤繁琐。有文献报道在流动相中加入乙酸和三乙胺来测定马钱子制剂中士的宁的含量[8,9]，本文通过在流动相中加入0.1%的甲酸和0.1%二乙胺，建立了马钱子散中士的宁含量测定的高效液相色谱方法。

1　仪器与材料

Waters 2695-2998型高效液相色谱仪(美国waters公司);MA110型电子分析天平(上海第二天平仪器厂)。士的宁对照品(中国药品生物制品检定所)。色谱甲醇(美国迪马公司);水为Milli-Q超纯水;其它试剂均为分析纯。马钱子散，按《中国药典》2005年版一部制得。

2　方法与结果

2.1　色谱条件

色谱柱：Diamonsil-C18柱(4.6×250 mm,5 μm)，以含0.1 %甲酸和0.1 %二乙胺的水溶液为流动相，检测波长为254 nm，流速为1.0 mg?mL-1，柱温30 ℃。

2.2　供试品溶液的制备

取本品粉末约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加氢氧化钠试液(1.075 mol?L-1)3 mL，混匀，放置30 min，精密加三氯甲烷20 mL，密塞，称定质量，置水浴中回流提取2 h，放冷，再称定质量，用三氯甲烷补足减失的质量，摇匀，用铺有少量无水硫酸钠的滤纸滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液3 mL，置10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3　对照品溶液的制备

称取士的宁对照品适量，用甲醇溶解，制得浓度为0.0292 mg?mL-1的对照品溶液。

2.4　方法学考察

系统适应性试验：分别吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10 μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录色谱图，见图1。供试品溶液色谱中士的宁峰分离度大于1.5，阴性液色谱中士的宁峰相应位置无干扰，士的宁理论板数大于2000。A：马钱子散;B：士的宁;C：阴性　图1　马钱子散中士的宁测定的高效液相色谱图

线性关系考察：取士的宁对照品，精密称取18.25 mg，用甲醇溶解定容于25 mL容量瓶中，得浓度为0.73 mg?mL-1士的宁对照品储备液。分别精密吸取0.1,0.2,0.4,0.6,0.8 mL，用甲醇稀释至10 mL容量瓶中，得浓度分别为0.0073,0.0146,0.0292,0.0438,0.0584 mg?mL-1的士的宁对照品溶液。分别精密吸取10 μL进样测定，记录峰面积，以对照品溶液浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，计算回归方程为Y = 66014612X-8491，r =0.9996，表明士的宁在0.0073～0.0584 mg?mL-1浓度呈良好的线性关系。

精密度试验：取同一供试品溶液，连续进样5次，每次10 μL。结果士的宁峰面积RSD值分别为1.5 %，表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取供试品溶液，在制备后0,2,4,8 h分别进样10 μL，各时间点士的宁峰面积RSD值为1.0 %，表明供试品溶液在8 h内稳定。

重现性试验：取同一批样品，按“2.2”项下方法制备6份供试品溶液，测定士的宁的含量，结果士的宁平均含量12.1063 mg?g-1，RSD为1.5 %，表明方法重现性较好。

加样回收率试验：取重现性试验所用样品，平行称取6份，每份约0.1 g，精密称定，置锥形瓶中，分别精密加入士的宁对照品贮备液1.7 mL，即1.241 mg，挥干甲醇后，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，进样10 μL，测定含量，并计算回收率，结果见表1。表明该方法准确度好。

2.5　样品含量测定

取3批马钱子散样品，分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，按“2.1”项下色谱条件测定士的宁峰面积，以外标法计算样品中士的宁含量，结果见表2。表1　加样回收率试验结果表2　样品含量测定结果

3　讨论和结论

3.1　马钱子及其制剂中士的宁含量测定的HPLC方法已有多篇报道，多数是在流动相中添加离子对试剂庚烷磺酸钠[7]，该物质价格昂贵，使分析成本增加，并且供试品溶液制备方法中应用了反复液液萃取的方法，操作步骤繁琐;在流动相中加入磷酸缓冲盐[7]，这要求在每次进样后设定一个色谱柱的冲洗-平衡步骤，即水相冲洗缓冲盐-甲醇相冲洗柱子-初始梯度平衡色谱柱，该步骤操作繁琐，初次使用者不易掌握。本实验采用在流动相中加入0.1 %甲酸和0.1 %二乙胺，既降低了分析成本，简化了分析步骤，又能实现士的宁的有效分离，简化了操作步骤。本实验还比较了流动相中添加二乙胺与三乙胺的洗脱效果，结果发现应用二乙胺时士的宁的分离效果更好。

3.2　本研究利用高效液相色谱法测定马钱子散中士的宁的含量，方法成本低、操作简便，灵敏度高，重复性好，可用于本品中士的宁的含量测定，有效控制本品质量。

【参考文献】

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[2]　王丹丹，李俊松，蔡宝昌.马钱子的炮制及其现代研究概况[J].河南中医，2008,28(10)：97-99.

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[4]　过振华，马红梅，张伯礼.马钱子药理毒理研究回顾及安全性研究[J].中西医结合学报，2008,6(6)：645-649.

[5]　耿万玲，张秀兰，史芳.马钱子散中士的宁定量方法的改进[J].齐鲁药事，1987,2：31-33.

[6]　中国药典.2010年版一部[S].2010：48.

[7]　张薇，卫昌华.高效液相色谱法测定跳骨片中士的宁的含量[J].中国实验方剂学杂志，2007,13(7)：7-9.

[8]　孙凌，李永吉，王艳宏，管庆霞，吕邵娃.高效液相色谱法测定接骨挫伤胶囊中士的宁含量[J].中国实验方剂学杂志，2011,17(16)：98-99.

[9]　李松林，陈邦元.RP-HPLC同时测定马钱子散中士的宁和马钱子碱的含量[J].中国药学杂志，1998,33(3)：167-169.