HPLC法拆分氟比洛芬对映体

氟比洛芬是一种非甾体类抗炎药，为消旋体，其中S型能更有效地抑制环氧化酶[1]，R型虽无抗炎作用，但近期研究证明，R型具有抗肿瘤活性，能抑制Aβ-42的表达，目前已进入治疗前列腺癌和阿尔兹海默病的Ⅲ期临床研究，并且在体内不会转化为(S)-氟比洛芬[2]。文献报道的氟比洛芬消旋体的拆分方法主要是化学法和生物法[3-8]。采用手性流动相添加剂HPLC法，手性固定相HPLC法拆分氟比洛芬对映体报道很少。本文采用两种高效液相色谱法对氟比洛芬对映体进行拆分。手性流动相添加剂法：利用C18柱，以β-环糊精衍生物作为手性流动相拆分剂进行拆分;手性固定相法：利用Chiral-pak AD手性色谱柱直接拆分。

1　材料与方法

1.1　主要仪器与试剂

日本岛津高效液相色谱仪：LC-10AVP;SPD-10A紫外检测器;C_R7A数据处理装置，RHEODYE77251型进样阀;氟比洛芬(浙江九洲药业股份有限公司)，乙腈、甲醇、异丙醇、正己烷、三乙胺均为色谱纯。

1.2　手性流动相添加剂HPLC法拆分氟比洛芬对映体

采用高效液相色谱法，利用C18柱，将β-环糊精(β-CD)、甲基-β-环糊精(M-β-CD)、羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)等作为手性流动相添加剂，系统地研究R，S-氟比洛芬在RP-HPLC系统中的拆分。

实验中所用的氟比洛芬样品溶液为2 mg/mL的甲醇溶液，进样前用0.45μm微孔滤膜过滤。药物拆分条件：分析柱为C18柱;流动相组成见图1，其中手性流动相添加剂为β-环糊精，甲基-β-环糊精，羟丙基-β-环糊精;流速为1 mL.min-1;进样量为10μl;检测波长为254nm;柱温25℃。

1.3　手性固定相HPLC法拆分氟比洛芬对映体

药物拆分条件：分析柱Chiral-pak AD柱(4.6mmX250mm，Daicel Chemical IND，LTD，日本);以正已烷-乙腈，正己烷-异丙醇作为流动相体系，并在流动相体系中添加适量三乙胺(TEA);流速为1.0mL?min-1;进样量10uL;检测波长为254nm;柱温25℃。

2　结果与讨论

2.1　手性流动相添加剂(CMPA)法

图1　S，R-氟比洛芬在三种拆分剂中的分离色谱图(a)2.0%β-CD的甲醇溶液(w/v)：pH为4.5的体积分数1%三乙胺水溶液(V/V)=25∶75;(b)2.0%M-β-CD的甲醇溶液(w/v)：pH为4.5的体积分数1%三乙胺水溶液(V/V)=25∶75;(c)2.0% HP-β-CD的甲醇溶液(w/v)：pH为4.5，体积分数1%的三乙胺水溶液(V/V)=25∶75

2.1.1　手性拆分剂的选择

分别考察了R，S-氟比洛芬在(a)、(b)、(c)三种流动相体系中的拆分情况，结果如图1。可知：R，S-氟比洛芬在流动相(a)(b)两种体系中均无法拆分，在流动相(c)只能部分分离，在相同的条件下HP-β-CD比M-β-CD拆分能力强。

2.1.2　有机修饰剂对拆分的影响

Ameyibor，E等利用高效液相色谱法，用环糊精及其衍生物β-环糊精作为手性流动相添加剂，拆分了非诺洛芬及优洛芬的对映异构体。由于氟比洛芬与非诺洛芬及优洛芬结构相似，我们以羟丙基-β-环糊精作为手性流动相添加剂，使用 C18柱对氟比洛芬对映异构体进行拆分，但拆分结果不是很理想。如表1所示，流动相为50%(v/v)甲醇时，氟比洛芬对映体得到了部分分离，随着甲醇浓度的降低，氟比洛芬对映体分离度有所改善。但仍不能达到基线分离。流动相中加入峰形修饰剂三乙胺，对分配系数和分离度都没有改善。

在实验过程中尝试了在流动相中添加乙腈、甲醇、乙醇等作为有机溶剂修饰剂。结果表明：在相同条件下，这3种有机修饰剂对氟比洛芬对映体拆分的影响很大，用乙醇和乙腈对氟比洛芬对映体都不能分离，而用甲醇时虽达不到基线分离，但可达到部分分离。综合考虑保留时间和分离度的影响，实验过程中用甲醇作为有机溶剂修饰剂较为合适。

以20 mmol?L-1的HP-β-CD，添加不同比例的甲醇为流动相分离S，R-氟比洛芬，容量因子(k)、手性选择性因子(α)和分离度(Rs)与甲醇体积分数的关系见表1，随着甲醇体积分数的逐渐增大，其容量因子呈逐步减小的趋势，手性选择性因子和分离度也减小。容量因子的减小可能是氟比洛芬分子的水溶性差，易溶于甲醇，而甲醇的存在可减小氟比洛芬与固定相的吸附;手性选择性因子和分离度的减小的可能原因：(1)甲醇与氟比洛芬分子竞争HP-β-CD空腔，抑制HP-β-CD对氟比洛芬的包络从而降低了对氟比洛芬对映体的立体选择性;(2)甲醇是极性有机溶剂，其浓度的增加降低了HP-β-CD空腔的疏水作用力，导致立体选择性降低;(3)上述两种影响共同作用的结果。表1　修饰剂甲醇浓度对氟比洛芬拆分的影响

2.1.3　流动相中HP-β-CD浓度对拆分的影响

HP-β-CD作为手性拆分剂，在流动相中所占比例势必对氟比洛芬对映体的分离产生很大影响。其影响结果见表2。由表2可知，随着HP-β-CD浓度的提高，容量因子迅速下降、手性选择性因子和分离度变化规律性不强，在1.1%时最大。虽然HP-β-CD的溶解性比β-CD要好，但是浓度过高，也会使该条件下的流动相变浑浊，导致色谱柱内压力过大，堵塞流路。其分离的典型色谱图见图2。表2　HP-β-环糊精浓度对拆分的影响图2　(R，S)-氟比洛芬的分离色谱图(1.1%HP-β-CD甲醇溶液(w/v)：pH为3.5，体积分数0.1%的三氟乙胺水溶液(V/V)=40∶60)

2.2　手性固定法(CSP)法

手性固定相法是高效液相色谱法拆分手性药物的方法之一，在众多的手性固定相中，直链淀粉-三[3,5-二甲基氨基甲酸酯]衍生物(Chiral-pak AD)应用较多。在Chiral-pak AD手性固定相上，氟比洛芬对映体不需要进行衍生化，就能很好地分离，其分离情况见表3。从表3中可以看出，在四种流动相中，氟比洛芬对映体都得到了较好的分离。其分离的典型色谱图见图3。

这跟手性固定相的拆分机制有关，一般认为对映体与CSP之间存在着偶极-偶极，氢键-氢键，π-π，空间位阻，疏水包合等多种相互作用，由于这些立体作用和电性作用的存在，使得两个对映体与CSP所形成的非对映体络合物的稳定性产生差别而实现分离。电负性大的氟和羰基基团有利于同CSP相互作用，另外芳环的存在，能与CSP形成较强的π-π相互作用。氢键作用影响较强。当流动相中的极性添加剂量增大以后，它与固定相之间产生的氢键作用抑制了对映体与固定相之间的相互作用，从而使对映体的保留减弱，使得对映体的容量因子和对映体分离因子同时减小。表中的数据显示了这一变化趋势，在有乙腈的流动相中对映体的容量因子大幅降低，对映体甚至不能分离。在有异丙醇的流动相中对映体的容量因子和对映体分离因子同时减小。 使用同一种改性剂，对映体分离因子的变化不大，但容量因子变化较大，这给实际分析带来便利，可以根据分析目的的不同，选择不同的流动相添加剂，调节对映体的出峰时间及分离度，使对映体的分离在适当的时间内以适当的方式完成。例如，在进行产品质量控制时，需要分析时间短，可选择较强和较多的极性添加剂。在进行对映体的制备性分离时，需要对映体的分离因子较大，则可以选择弱极性的添加剂或较少的极性添加剂。表3　氟比洛芬在Chiral-pak AD手性柱上的对映体分离图3　氟比洛芬在Chiral-pak AD手性柱上的对映体分离(流动相：正己烷：体积分数0.05%(v/v)三乙胺的乙腈溶液(90：10v/v)

3　结论

3.1　采用高效液相色谱法，利用C18柱，使用β-环糊精，甲基-β-环糊精，羟丙基β-环糊精作为手性流动相拆分剂，调节流动相中有机修饰剂甲醇浓度，调节手性流动相添加剂羟丙基环糊精浓度，调节峰型修饰剂的浓度等都不能使氟比洛芬对映体得以较好的分离，只能部分分离。

3.2　采用高效液相色谱法，直接应用Chiralpak AD 手性色谱柱，选用合适的流动相，适宜的有机修饰剂，峰型修饰剂，氟比洛芬对映体得以良好的分离。当流动相为：正己烷：体积分数0.05%(v/v)三乙胺的乙腈溶液(90：10v/v)分离因子为1.68，分离度为10.0。

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