益肾胶囊的质量控制

益肾胶囊组方系陕西省名老中医乔成林教授针对慢性肾小球肾炎患者的蛋白尿、血尿研制的医院内制剂(陕药制字[2001]第1424号),处方由黄芪、山茱萸、丹参、丹皮、女贞子、熟地、茯苓、泽泻、川芎等组成。在临床应用多年,疗效确切,尤其对慢性肾小球肾炎具有很好的治疗作用,能够显著降低慢性肾小球肾炎患者尿蛋白及血清白细胞介素6,白细胞介素-8水平[1⒓]。为保证临床用药安全有效,笔者采用薄层色谱法对处方中黄芪、山茱萸、丹参和丹皮进行定性鉴别;采用高效液相色谱法对制剂中的丹参酮ⅡA进行了含量测定,为该制剂制订质量标准提供依据。

1 仪器与试药

1.1仪器Waters510液相色谱仪(包括Waters510PLC泵,486检测器,N2000色谱数据工作站);UV-2550型紫外可见分光光度仪(日本岛津);HI1-2型数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司);WHC⒈350超声波药品处理机(济宁万和超声电子没各有限公司);MB型封闭电炉(北京科伟永兴仪器有限公司);旋转蒸发仪RE-52AA(上海亚荣生化仪器厂);电子天平AE6220G(日本岛津);微量分析天平TG-332A(湘仪天平仪器)。

1.2 试药 硅胶G(青岛海洋化工厂),硅胶GF254(荧光化学厂);黄芪甲苷对照晶(批号:110781-200613)、马钱苷对照品(批号:111640200604)、丹参酮ⅡA对照品(批号:11OT狁200619)、丹皮酚对照品(批号:OTOg-97O-I)均购自中国食品药品检定研究院;益肾胶囊(西安交通大学第二附属医院制剂室);甲醇为色谱纯;水为超纯水;其余试剂均为分析纯 

2方法与结果 

2.1薄层色谱鉴别

2.1.1黄芪甲苷的薄层色谱鉴别取益肾胶囊内容物约2g,称定质量,滤纸包裹后置索氏提取器中加甲醇硐mL冷浸过夜,再加甲醇适量,加热回流至提取液无色,回收甲醇浓缩至干9残渣加水10mL微热便溶解,转移至分液漏斗中,水饱和的正丁醇振摇提取3次(40,40,40mL),合并正丁醇液,氨试液充分洗涤两次(20,20mL),正丁醇液蒸干氵残渣加水5mL使溶解,过D101型大孔吸附树脂柱(内径为37.5px,柱为300px),以水50mL洗脱,弃水液,再以+t)%乙醇501nL洗脱9弃去洗脱液,再以乙醇洗脱,收集洗脱液”蒸干,残渣用甲醇溶解并定容于2mL量瓶中,作为供试品溶液。另取黄芪药材和不含黄芪药材的胶囊内容物,按上述方法制各成黄芪阳性对照液和阴性对照液,再取黄芪甲苷适量,加甲醇制成浓度为1mg·m91的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法,分别吸取上述溶液各5ul`,点于同一硅胶G板上9以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(5∶12∶8∶2)为展开剂,展开,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,于lO5℃加热至斑点显色清晰。可见,供试品色谱在与黄芪甲苷对照品色谱及黄芪对照药材色谱相应位置上显相同颜色的斑点,阴性对照无干扰(图1A)。

2.1.2马钱苷的薄层色谱鉴别取益肾胶囊内容物约1.5g,称定质量,加80%甲醇乃mL,加热回流置h,滤过,滤液蒸干后加水20mL溶解,水饱和的正丁醇振摇萃取3次(20,20,20mL),合并正丁醇液,蒸干,残渣加甲醇定容至2L量瓶中,作为供试品溶液[4];另取山茱萸药材和不含山茱萸药材的胶囊内容物,按上述方法制备成山茱萸阳性对照溶液和阴性对照溶液,再取马钱苷适量,加甲醇制成浓度为2mg。mL1的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法,吸取上述4种溶液各5uL,分别点于硅胶G板上,以乙酸乙酯-乙醇¨冰乙酸(50∶10∶1)为展开剂,展开,取出,晾干9喷以5%香草醛硫酸溶液,在105℃下加热至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与马钱苷对照品与山茱萸对照药材色谱相应的位置,显相同的紫红色斑点,阴性对照无干扰(图1B)。

2.1.3丹参酮ⅡA的薄层色谱鉴别取益肾胶囊内容物5g,加三氯甲烷佃mL,水浴回流提取翎min,滤过,浓缩至5mL,做为供试品溶液;另取丹参药材和不含丹参药材的胶囊内容物,按上述方法制备成丹参阳性对照溶液和阴性对照溶液,取丹参酮ⅡA对照品适量,加三氯甲烷制成浓度为2mg·mL1的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法,分别吸取上述溶液各5uL,分别点于硅胶G”54板上,以石油醚(60~20℃)-乙酸乙酯(4∶1)为展开剂[5],展开,取出,晾干。供试品色谱在与丹参酮ⅡA对照品和丹参对照药材色谱相应的位置上,日光下观察显相同的暗红色斑点(图1C1),在紫外灯笏4nm下观察显相同颜色斑点,阴性对照无干扰(图1C2)。

2.1.4丹皮酚的薄层色谱鉴别取益肾胶囊内容物约12g,称定质量,加乙醚10mL,水浴加热回流Ih,滤过,滤液挥干,残渣加丙酮2使溶解,做为供试品溶液;另取丹皮药材和不含丹皮药材的胶囊内容物,按上述方法制各成丹皮阳性对照液和阴性对照液,再取丹皮酚对照品适量,加丙酮制成浓度为2mg·mL1的对照品溶液。照薄层色谱法,分别吸取上述溶液各10uL,点于同一硅胶G薄层板上,以环己烷-乙酸乙酯-冰醋酸(4∶1.5∶0.5)为展开剂展开,取出,晾干。喷以5%酸性三氯化铁醇溶液[6],热风吹至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与丹皮酚对照品和丹皮对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,阴性对照无干扰(图1D)。

2.2含量测定

2.2.1色谱条件色谱柱:细oma⒍lC1:色谱柱(4.6mm×25O mm,5um);流动相:甲醇-水(85∶15);检测波长:岁0nm;流速:1.0mL·而n1;柱温:室温;进样量:20uL。在此条件下,丹参酮ⅡA峰与其他组分均能达到基线分离,理论板数以丹参酮ⅡA计算不低于3OO0。

2.2.2对照品溶液与供试品溶液的制各精密称取丹参酮ⅡA对照品适量,加甲醇制成浓度为16ug·mL1的溶液,作为对照品溶液。取胶囊内容物约035g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加人甲醇25mL,称定质量;加热回流1h,放冷,用甲醇补足减失的质量,摇匀,滤过,取续滤液,过孔径微孔滤膜,即得供试品溶液。取缺丹参的阴性样品同法制各阴性对照品溶液。

2.2.3专属性实验阴性对照实验精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液各20uL,分别注人液相色谱仪,记录色谱图,结果阴性对照品溶液中其他成分对丹参酮ⅡA的测定无干扰。

2.2.3.1线性关系的考察取上述对照品溶液,分别精密吸取0,5,1.0,2,0,3,0,4.0,5.0mL至10mL棕色量瓶中,用甲醇定容。按上述色谱条件分别注入色谱仪,测定,记录峰面积,以丹参酮ⅡA峰面积(y)对浓度(X)进行回归,得到回归曲线。结果表明,丹参酮ⅡA进样浓度在0,8~8.0ug·mL1范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.2.3.2精密度实验吸取上述对照品溶液20uL,连续进样6次,记录其峰面积,RSD为(Ⅱ=6),表明本方法精密度良好。

2,2.3.3重复性实验精密称取同一批(批号:20120208)样品,按供试品溶液制备方法制备供试品溶液5份,按上述色谱条件进行,测定,结果RSD为1.20%(n=5),表明本方法重复性良好。

2,2,3,4稳定性实验吸取同一供试品溶液溶液(批号:20120308),分别于0,2,4,6,12,9ZI h,按上述色谱条件测定峰面积,结果RSD为1.OO%(n=6),表明供试品溶液至少在24h内稳定。

2.235加样回收率实验取已知含量的样品(含量约为111,9ug·g1)9份各约0.35g,精密称定质量,分别精密加入一定质量的丹参酮ⅡA对照品溶液适量,照“2.2.2”项下方法制各供试品溶液,按上述色谱条件测定,计算回收率,结果平均回收率98.88%,RSD=1.84%,见表1。

2,3.4样品含量测定取样品3批(批号:201201O3,20120205,20120308),按上述方法配置和测定,结果3批样品中丹参酮ⅡA的含量分别为113.3,110,6和111,8ug。g1(n=3)。结合多批次益肾胶囊的含量测定,笔者将益肾胶囊中丹参酮ⅡA的含量定为最低应不少于100ug·g1。

3讨论

2010年版《中华人民共和国药典》中丹皮酚的薄层鉴别实验时,以环己烷-乙酸乙酯-冰醋酸(4：1：0.1)为展开剂,2%香草醛硫酸乙醇溶液显色,效果不佳,未能达到理想的分离效果。查阅文献后,笔者将展开剂极性增加,改为环己烷-乙酸乙酯-冰醋酸(4∶15∶0.5),各组分达到了良好的分离;显色剂改用5%酸性三氯化铁乙醇溶液,显色效果较好。

丹参酮ΠA的含量测定,《中华人民共和国药典》用的流动相是甲醇:水(75∶25),保留时间为33min,时间较长,故增加了流动相中甲醇的比例,即甲醇-水(85:15)作为流动相,样品约在13min处出峰,与各杂质的分离度)1.5,效果良好。丹参酮ⅡA对光敏感,为保持样品稳定性,实验中均采用避光操作,用棕色量瓶配置相关溶液。

仵文英等[7]曾采用薄层扫描法测定黄芪中黄芪甲苷的含量和以山茱萸中的熊果酸做定性鉴别。研究表明[8],丹参能够提高血及肾组织中超氧化物歧化酶活性,降低丙二醛含量,使血肌酐下降,改善肾功能,且在制各过程中受温度等因素影响致使不同批次益肾胶囊中的丹参酮ⅡA含量有一定差异,故笔者改为高效液相色谱法测定制剂中丹参酮ⅡA的含量,操作简便、准确,重复性好。处方中女贞子和山茱萸中均含有熊果酸,用其做山茱萸定性鉴别专属性差,《中华人民共和国药典》采用马钱苷作为山茱萸的定性鉴别之一,故笔者采用薄层色谱法对黄芪、山茱萸、丹参及丹皮进行了定性鉴别,建立了益l肾胶囊的质量控制方法,该方法稳定可靠,操作简便且专属性强,可作为益肾胶囊的质量控制标准.

参考文献：

[1]吴喜利,乔成林,孙万森.益肾胶囊对慢性肾小球肾炎患者尿蛋白及NK细胞的影响[J].第四军医大学学报,2003,(17):1591-1592.

[2]吴喜利,孙万森,张王刚.益肾胶囊对慢性肾小球肾炎患者血清血管内皮生长因子及细胞免疫的影响[J].中国中药杂志,2007,(32):2416-2418.

[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京:中国医药科技出版社,2010.283-284.

[4]柴金苗.复明片的质量标准研究[J].中华中医药学刊,2011,(01):50-52.

[5]王宝琴.中成药质量标准与标准物质研究[M].北京:中国医药科技出版社,1994.244.

[6]高莹莹,孙秋,常波.人参固本丸中丹皮酚的薄层色谱鉴别[J].中华医药指南,2011,(34):306-307.

[7]仵文英,李兴华,王美纳.益肾胶囊的质量标准[J].中国医院药学杂志,2003,(03):142-143.

[8]SOLTERO L,CARBAJAL H,SARKISSIAN N.A truncated-dose regimen of daclizumab for prevention of acute rejection in kidney transplant recipients:a single-center experience[J].Transplantation,2004,(10):1560-1563.