偶联EGFR单抗C225的Fe3O4/Ag复合纳米颗粒的抗体活性鉴定及其对鼻咽癌细胞增殖的作用

作者             单位

赵迪　　   东南大学 医学院，江苏 南京 210009

孙新臣　　 东南大学 医学院，江苏 南京 210009

马珺　　   东南大学 医学院，江苏 南京 210009

童金龙　　 东南大学 医学院，江苏 南京 210009

徐睿智　　 东南大学 医学院，江苏 南京 210009

放射治疗是恶性肿瘤的主要治疗手段之一，随着放疗设备、影像技术等快速发展，出现了三维调强适形放射治疗(IMRT)[1]。临床上至今未能有理想经影像介导的IMRT的示踪剂，这也是放射生物学中亟待解决的问题和当前研究的热点之一。本实验研究具有自主知识产权的复合纳米颗粒Fe3O4/Ag/C225，该复合颗粒Fe3O4可以在调强适形放射治疗中示踪肿瘤，Ag在前期工作中发现可以作为放射增敏剂，而EGFR单抗C225起到靶向肿瘤的作用。本研究主要探讨复合颗粒Fe3O4/Ag/C225在体外的稳定性、靶向性及对鼻咽癌细胞抑制作用。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

二甲基亚砜(DMSO，Sigma公司)，HEPES、胰酶、噻唑蓝(Amersco公司)等均为分析纯，DMEM(Gibco Bd公司，美国)，小牛血清(杭州四季青生物工程公司)，酶标仪(美国BD公司)，CNE(购自中国科学院上海细胞研究所)。

1.2 试验方法

1.2.1 体外释药速率 用生理盐水配成10 g·L-1的混悬液，取10 ml装于透析袋中，外面透析介质亦为生理盐水，磁力搅拌器常温搅拌50 h，每隔1 h取液测量释放液中Ag含量，绘制累积释药曲线。

1.2.2 细胞株和细胞培养 鼻咽癌细胞株CNE常规培养于含10%小牛血清的1640培养液中，置于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中。

1.2.3 MTT比色法检测细胞增殖抑制率 取对数生长期CNE细胞，消化吹打成2.5×104 ml-1，在两块96孔培养板中每孔接种200 μl(每板两组，每组8个复孔),置于37 ℃、5%CO2培养箱培养。24 h细胞贴壁后一块培养板分别加入1640培养液(阴性对照组)，100、200、400、800μg·ml-1 Fe3O4/Ag/C225， 48h后加入MTT 20 μl， 4 h后弃去液体，每孔加入150 μl DMSO，置于酶标仪上振荡混匀10 min测OD493 nm值，细胞增殖抑制率=(1-实验组OD值/对照组OD值)。

1.2.4 酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测 取第2代培养的鼻咽癌细胞按2×107 L-1 接种于96孔灭菌酶标板中，100 μl·孔-1，5% CO2、37 ℃培养24 h。洗涤4次后晾干，加入4 ℃预冷的0.25%戊二醇缓冲溶液， 4 ℃固定30 min。每孔加300 μl 1% BSA缓冲溶液，37 ℃封闭1 h，洗涤2次，吸净残留液体。稀释缓冲液将单克隆抗体和Fe3O4/Ag/C225按单克隆抗体量梯度稀释，每孔加入100 μl，每组设6个平行孔。缓冲溶液作阴性对照， 37 ℃孵育1 h。洗涤2次，加入HRP羊抗鼠Ig (1 ∶2 000 稀释)100 μl·孔-1,37 ℃孵育1 h。洗涤2次，加入底物液100 μl·孔-1，37 ℃避光反应15～20 min,加终止液50 μl。酶标仪检测492 nm波长处A 值，以C225和Fe3O4/Ag/C225的吸光值对应抗体浓度列表。

1.3 统计学处理 采用SPSS 11.5软件处理系统进行统计学分析。数据以±s表示，采用t检验及方差分析作组间均数比较，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 复合纳米颗粒结构示意图

2.2 体外释药速率的动态测定结果

以生理盐水为介质考察Fe3O4/Ag/C225复合纳米颗粒中Ag的体外动态释放，计算其累积释放率，48 h释药为15.96%(图2)。

2.3 复合纳米颗粒Fe3O4/Ag/C225的抗肿瘤作用

2.3.1 倒置显微镜下所见 正常的CNE细胞呈多边形多角形，胞质伸展，大小一致，细胞之间相互衔接，排列紧密。细胞数量多，贴壁良好，无细胞破裂及细胞碎片。光镜下复合纳米颗粒处理细胞48 h后，细胞生长明显受到抑制，细胞数量明显减少，部分细胞已变圆、回缩。当浓度达到800 μg·ml-1时体外处理组可见大量细胞变圆、回缩，并从培养瓶壁脱落悬浮于培养基中，说明复合纳米颗粒Fe3O4/Ag/C225有明显的抑制鼻咽癌细胞的作用(图3)。

2.3.2 MTT比色法检测结果 Fe3O4/Ag/C225能显著抑制鼻咽癌细胞株CNE增殖，见表1。

2.4 ELISA法检测结果

ELISA结果显示，复合纳米颗粒Fe3O4/Ag/C225中的C225的活性保存良好(表2、图4)。

3 讨 论

放射治疗是恶性肿瘤的主要治疗手段之一，据统计约70%的肿瘤患者在治疗的不同时期需要进行放射治疗[2]。IGRT是一种精确放疗技术，靶区内各点的剂量能按设定的要求进行调整，达到靶区内肿瘤体积的剂量最优化。因此IGRT减少了周围正常组织的受照射剂量，是当前放疗领域在三维上考虑肿瘤形状、密度并考虑时间因子的先进技术。但临床上至今未能有理想的示踪剂显示肿瘤的微浸润病灶，成为该项技术进一步发展的瓶颈。当前广泛研究的示踪剂在分辨力、敏感性、特异性及安全性方面都存在或多或少的缺陷。如放射性核素显像方法可以用来评价移植细胞的活性功能，敏感性极高，但空间分辨率太低，且其安全性还远未得到深入评估。荧光成像技术，其背景干净，敏感性极高，但其只能用于动物实验研究、空间分辨力差、解剖细节对应关系不强、光线探测深度较浅等缺陷，注定了其临床应用价值有限[3-7]。

Fe3O4/Ag / C225 多功能复合纳米颗粒Fe3O4/Ag/C225是我们课题组前期成功制备的，具有自主知识产权的新型抗肿瘤制剂。超顺磁Fe3O4纳米颗粒[8]具有在磁共振下成像的特性， C225既具有抑制肿瘤细胞的效应，同时又具有放射增敏效应。我们课题组前期研究证明纳米Ag颗粒可以增加放射线对肿瘤细胞杀灭作用，有可能成为肿瘤放射治疗的增敏剂[9]。应用复合纳米颗粒中的Fe3O4做为磁共振下成像的显像剂，可能为体内调强放射治疗提供肿瘤细胞的示踪图像。实验中我们首先证实了这种新型材料具有良好的释控性，稳定性好。MTT比色法检测结果显示，Fe3O4/Ag/C225对鼻咽癌细胞株CNE增殖具有良好的抑制性。为了验证当EGFR单抗链接在Fe3O4/Ag上时是否很好地保持了抗体的活性，我们通过ELISA法检测了复合颗粒Fe3O4/Ag/C225中C225的活性，结果显示抗体活性保存良好。

通过本研究，在已构建的基于生物纳米磁性材料的示踪、增敏、抗肿瘤多功能平台上，从分子影像学、肿瘤分子靶向治疗的角度探讨复合纳米颗粒Fe3O4/Ag/C225在体外蛋白及基因水平上的作用机制、在体内的疗效及可能的作用机制，为分子影像引导的调强放射治疗提供一个无创动态的研究手段。

【参考文献】

[1] TANG G, EARL M A, LUAN S,et al. Comparing radiation treatments using intensitymodulated beams, multiple arcs, and single arcs[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys， 2010，76(5):15541562.

[2] DENNIS K E, DUNCAN G. Radiation oncology in undergraduate medical education: a literature review[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys， 2010,76(3):649655.

[3] HOFFMAN J M， GAMBHIR S S. Molecular imaging: the vision and opportunity for radiology in the future[J]. Radiology，2007，244(1):3947.

[4] HAUGER O， FROST E E， VAN H R， et al. MR evaluation of the glomerular homing of magnetically labeled mesenchymal stem cells in a rat model of nephropathy[J]. Radiology， 2006，238(1):200210

[5] BARNETT B P， AREPALLY A， KARMARKAR P V, et al. Magnetic resonanceguided， realtime targeted delivery and imaging of magnetocapsules immunoprotecting pancreatic islet cells[J]. Nat Med，2007，13(8):986991.

[6] TAI J H， FOSTER P， ROSALES A， et al. Imaging islets labeled with magnetic nanoparticles at 1.5 Tesla[J]. Diabetes，2006，55(11):29312938.

[7] POLITI L S. MRbased imaging of neural stem cells[J]. Neuroradiology，2007，49(6):523534.

[8] DAVE S R, GAO X. Monodisperse magnetic nanoparticles for biodetection, imaging,and drug delivery: a versatile and evolving technology[J]. Nanomed Nanobiotechnol， 2009 ,1(6):583609.

[9] XU R Z, MA J, SUN X C, et al. Ag nanoparticles sensitize IRinducedkilling of cancer cells[J]. Cell Res， 2009，19(8):10311034