二甲双胍在健康人体的生物等效性

盐酸二甲双胍是双胍类降糖药,它通过抑制肝脏的糖异生并促使外周胰岛素靶组织对葡萄糖的摄取利用,增强机体对胰岛素的敏感性。目前,国内外对血浆样本中二甲双胍的测定方法有气相色谱法(GC)、毛细管电泳法(CE)、液相色谱法(LC-UV)等[l,2],但都存在一定的局限性,如方法灵敏度较低、定量下限较低,无法满足盐酸二甲双胍口服制剂的人体药代动力学的研究;也有用LC-MS/MS方法,但仍存在样本的处理过程复杂等。本实验拟建立高效、灵敏、准确、专属性强的LC-MS/MS方法,并评价新药的生物等效性。

材料、对象与方法

1  药品与仪器

受试药物盐酸二甲双胍片,规格:每片500mg,批号:100801,德州博诚制药有限公司生产;参比药物盐酸二甲双胍片,规格:每片5O0mg,批号:1004063,中美上海施贵宝制药有限公司生产;二甲双胍标准品,批号:100664-200602;苯乙双胍标准品(内标),规格:100mg,批号:100753-200501,均由中国药品生物制品检定所提供。

API3000三重四极杆串联质谱仪,美国Applied Biosystem公司产品;1200高效液相色谱系统,美国Agilent公司产品。

2  受试者选择

本试验军事医学科学院附属医院伦理委员会通过,受试者签署知情同意书。筛查时,询问受试者人口学资料,进行完整病史回顾、生命体征和体格检查,心电图,血常规、血生化、血清学,尿常规等检查。24名中国男性健康受试者,平均年龄为(24.2±3.5)岁,身高(172.5±5.5)cm,体重(64.3±7.4)kg,体重指数为(21.5±1.4)kg·m-2。

3  给药方法与血样采集

双周期、随机、自身交叉试验设计。24名受试者分别服用二甲双胍受试药物或参比药物5O0mg,温开水200mL(含50g葡萄糖)送服并做记录,用药间隔7d。

于给药前及给药后0.5,1.0,1.5,2,3,4,5,6,8,10,12,15,24h各取静脉血5mL,置于肝素处理的试管中,常温下静置0.5h,3000r·min-1离心10min,分离血浆,置-40℃冰箱保存。

4  血药浓度测定

4.1  测定条件

色谱条件  色谱柱:Luna5u CN100A(2.0mm×15O mm,5um);流动相:甲醇-3O mmd·L-1乙酸铵水溶液(80∶20);流速:0.3mL·min -1;柱温:25℃;进样量:5uL。

质谱条件  电喷雾离子化源(ESI);正离子检测;多反应监测(MRM);喷射电压5400Ⅴ;离子源温度450℃;源内气体1(GS1,N2):82.8kPa;源内气体2(GS2,N2):48.3kPa;气帘气体(N2):55.2kPa;解簇电压:30Ⅴ;碰撞电压:30Ⅴ。定量分析离子反应质荷比,二甲双胍:m/z130.0→m/z71.0,苯乙双胍钙,m/z 206.2→m/z105.2。

4.2  血样本处理

量取血浆样品200uL,分别加人10OOng·mL -1苯乙双胍钙乙腈溶液(内标)50uL,涡旋均匀,加人乙腈700uL,涡旋均匀,16000r·min4℃离心10min,取上清液5uL进样分析。

5  方法学考察

5.1  专属性

空白血浆;加入二甲双胍标准溶液和内标溶液的空白血浆;受试者给药后的血浆样品色谱图,二甲双胍和苯乙双胍的保留时间分别为3.88,4.26min。结果表明,空白血浆中的内源性物质不干扰测定。

5.2  标准曲线与定量下限

取空白血浆200uL,甲醇稀释配成浓度分别为25,50,100,250,500,1000,2000,2500ng·mL -1的标准含药血浆溶液,加人内标溶液5O uL,旋涡混匀,按“血样本处理”操作,以待测物浓度为横坐标(X),待测物与内标的峰面积比值为纵坐标(Y),用加权最小二乘法进行回归运算,杈重系数w=1/X2,回归方程y=2.79×10-3X-5.49×10-2,r=0.9960。线性范围为25~25O0ng·mL-1,定量下限为25ng·mL-1。

5.3  精密度与回收率

配制50,250,2000nbg·mL-1质控样品,按“血样本处理”操作,每浓度6份,随行一条标准曲线,连续测3批,且连续测3d,盐酸二甲双胍和内标峰面积的比值f,代入当天的标准曲线求得实测浓度,计算批内和批间精密度。采取上述同样的处理方法,将比值f代人当天的标准曲线方程,计算实测浓度与加人浓度的比值,即相对回收率,见表1。

5.4  基质效应

50,250,2000ng·mL-1二甲双胍,标准含药血浆200uL,每浓度3份,再加人内标溶液,1组加入700 uL空白血浆上清液(除不加内标溶液外,其余步骤相同),处理后,基质效应分别(105.78±0.43),(98.54±25.52),(106.87±7.82)ug·L-1。

5.6  稳定性

进样器放置4h、室温放置4h、反复冻融3次和-40℃冰冻放置5个月,结果显示RE均<15%。

6  统计学处理

用Phoenix WinNonhn6.1计算药代动力学参数,AUC、Cmax经对数转换后进行方差分析、双单侧莎检验和90%置信区间分析,对tmax进行非参数法检验。

结果

1  血药浓度-时间曲线

24名受试者口服盐酸二甲双胍片受试药物和参比药物后的平均血药浓度-时间曲线,见图1。

2  药代动力学参数

以名受试者口服盐酸二甲双胍片受试药物和参比药物后主要药代动力学参数,见表2。

3  生物等效性评价

AUC0-tn,AUCO-∞,(受试/参比)的90%置信区间分别为87.4%~102.6%,87.5%~102.1%,Cmax的(受试/参比)的9O%置信区间为83.1%~101.4%;用非参数法对tmax滥的实测值进行检验(P>0.O5),表明tmax在受试与参比药物差异无统计学意义。

讨论

二甲双胍的极性较强,且口服制剂的人体药代动力学参数个体差异较大,用LC-MS/MS测定血浆中二甲双胍的浓度[4],可以减少分析测定方法受到的基质效应影响,具有较高的灵敏度,乙腈沉淀蛋白前处理方法,简单快速,并进行了系统的方法学确证,解决了二甲双胍因极性强,在一般反相C18色谱柱难以保留的问题,减少了沉淀蛋白后生物样本中基质对二甲双胍的测定影响,很好的符合体内药物方法分析的要求。通过对二甲双胍的AUC、Cmax经对数转换后进行方差分析、双单侧莎检验和9O%置信区间分析,对莎Ⅱ旺进行非参数法检验,最终证实试验与参比药物盐酸二甲双胍片等效。

参考文献

[1]曲斌,杭太俊,江丽. HPLC法测定人血浆中盐酸二甲双肌的浓度及其在药动学研究中的应用[J].中国新药杂志,2004.637-640.

[2]文彤,丁劲松,朱运贵. 复方盐酸二甲双胍片的人体相对生物利用度[J].中南药学,2006.118-121.

[3]张冬慧,李琳,龚慧敏. 国产与进口尼麦角林片在健康人体的生物等效性[J].中国临床药理学杂志,2012.33-36.

[4]李雪宁,陈伟力,徐红蓉. 国产格列本脲和二甲双胍复方制剂在健康志愿者的药代动力学和生物等效性[J].中国临床药理学杂志,2004.354-358.