两种制备方法的紫癜方治疗ITP模型小鼠的药效研究

作者                         作者单位

张林             辽宁中医药大学基础医学院 沈阳 110032

马骥             辽宁中医药大学基础医学院 沈阳 110032

林淑茹           辽宁中医药大学基础医学院 沈阳 110032

特发性血小板减少性紫癜(ITP)是一种常见的出血性疾病。本文从药效学指标比较两种制备方法提取的紫癜方治疗ITP的作用差异，从而明确紫癜方的制备方法对其效用的影响。

材料与方法

1 材料

1.1 动物

SPF级健康BALB/C小鼠，体重为(18～22)g，雌雄各半，动物许可证号：SCXK(京)2002～0003，由北京维通利华实验技术有限公司提供。豚鼠，体重为(250～350)g，普通级，4～6周龄，动物许可证号：SCXK(吉)2003～0004，由吉林省实验动物质量检测中心提供。

1.2 药物

方剂紫癜方：由黄芪25g,制大黄15g,生晒参10g,阿胶25g,桃仁10g,生地10g,白芍20g,仙鹤草15g,当归10g,甘草10g组成。全部药材购自沈阳天益堂药房。

制备方法一(紫癜水提方)：方中药物常规煎煮水提，加水1500ml(药量的10倍量)，浸泡30min，煎煮时间为25min，收集药液，取过滤后药物加水1200ml(药量的8倍量)，按照前述方法再次煎煮，将两次煎煮后的药液混合浓缩成100%(含生药1g/ml)备用。

制备方法二(紫癜工艺方)：方中大黄、人参5g和白芍用240ml(药量的6倍量)70%乙醇回流提取2次，每次2小时，回收乙醇至无醇味，形成药液一;药渣和黄芪、桃仁、生地、仙鹤草、当归和甘草加水1200ml(药量的10倍量)，浸泡30min，煎煮时间为25min，收集药液，取过滤后药物加水900ml(药量的8倍量)，按照前述方法再次煎煮，将两次煎煮后的药液混合为药液二，将药液一和药液二合并，浓缩成100%(含生药1g/ml)的浓缩液;人参5g粉碎过100目筛兑入浓缩液;阿胶粉碎成粗粉加热兑入。

醋酸泼尼松片由天津太平洋制药有限公司生产(国药准字H12020809)。将醋酸泼尼松片研成粉末，用生理盐水配成混悬液(0.3g/L)。血美安胶囊由贵州正鑫药业有限公司提供(国药准字Z20044441)。将血美安胶囊中颗粒状内容物用生理盐水配配成混悬液(32g/L)。

1.3 试剂

完全弗氏佐剂，SIGMA原装，购自沈阳方隆生物技术有限责任公司，批号：065K8910;不完全弗氏佐剂，SIGMA原装，购自沈阳方隆生物技术有限责任公司，批号：105K8907;血小板洗涤液配制：NaCl、Na2HPO4、NaH2PO4、EDTANa2、蒸馏水。

1.4 仪器

全自动多物种五分类动物血液分析仪，由英国DREW Scientific Inc.生产(型号：HEMAVET 950FS)。

2 方法

2.1 动物分组与处理

BALB/C小鼠随机分为6组：正常组(C)、模型组(M)、醋酸泼尼松组(DC)、血美安组(X)、紫癜水提组(S)和紫癜工艺组(G)，每组10只。

造模方法：模型建立参照文献[1]，加以改进。BALB/C小鼠眶静脉采血，EDTANa2抗凝，分离血小板并洗涤。取已制备的血小板悬液分别与等量的完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂混匀。第1周取含完全弗氏佐剂的抗原分别注射于豚鼠的后足掌、背部及腹股沟皮下;第2、3、5周取含不完全弗氏佐剂的抗原分别注射于豚鼠的后足掌、背部及腹股沟皮下。前后共注射4次，每次注射5点，每点100μl;第6周取豚鼠不抗凝全血，3000r/min离心10min后取上清，即为豚鼠抗小鼠血小板血清(GPAPS)，置56℃水浴30min补体灭活，生理盐水稀释后，采用琼脂扩散法检验抗体效价，-20℃冰箱储存备用。

除正常组外其余五组小鼠在实验的1、3、5、7、9、11、13天，将豚鼠抗小鼠血小板血清(APS)按100μl/20g体重的剂量注射于腹腔。

给药方法：各组小鼠从验第一天开始灌胃。其中S组小鼠按25g/(kg·d)给予紫癜水提方灌胃;G组小鼠按25g/(kg·d)给予紫癜工艺方灌胃;DC组小鼠按5mg/(kg·d)给予醋酸泼尼松混悬液灌胃;X组小鼠按0.8g/(kg·d)给予血美安混悬液灌胃;其余各组小鼠灌服等容积的生理盐水(0.2ml/20g)体重。每日灌胃1次，连续灌胃14d。

2.2 指标测定

2.2.1 皮下紫癜情况观察

实验结束前按照文献[2]所述方法记录小鼠出血程度。Ⅰ级：注射部位轻度出血，其他部位有散在出血点。Ⅱ级：注射部位明显出血，并见有其他部位瘀斑、瘀点。Ⅲ级：注射部位严重出血，皮肤大量瘀斑、瘀点，可见皮肤发黑或破溃。

2.2.2 体重检测

于造模前、实验第7天和实验第14天分别测量各组小鼠体重。

2.2.3 血小板数检测

于造模前和实验第14天各组小鼠眶静脉采血20μl，滴入抗凝管中，用全自动多物种五分类动物血液分析仪检测血小板数。

2.3 数据的统计处理

所得数据均用x±s表示，用SPSS 11.0 for windows 软件统计处理，先采用单因素方差分析(oneway ANOVA)进行检验，后经多组间比较，采用StudentNewmanKeuls检验。计数资料采用等级秩和检验。

3 结果

3.1 紫癜方对ITP模型小鼠皮下紫癜情况的影响

实验结束时各组小鼠皮下紫癜情况(出血程度)见表1。表1 各组小鼠皮下紫癜情况(略)与正常组比较，*P<0.01，**P<0.05;与模型组比较，#P<0.01

3.2 紫癜方对ITP模型小鼠不同时间点体重的影响

造模前、实验第7天和实验第14天各组小鼠体重变化见图1。

3.3 紫癜方对ITP模型小鼠不同时间点血小板数的影响

造模前和实验第14天各组小鼠血小板数的变化见表2。表2 不同时间点各组小鼠血小板计数(略 )

与正常组比较，*P<0.01;与模型组比较，#P<0.01;与醋酸泼尼松组比较，△P<0.01与血美安组比较，☆P<0.01

4 讨论

以ITP中医发病病机中关于“气虚血瘀血热”的理论作为基础，并依据中医临床经验组成了治疗ITP的中医方剂紫癜方。该方由10味中药组成：黄芪、制大黄、人参、当归、桃仁、阿胶、白芍、生地、仙鹤草和甘草。全方配伍有补气养血，活血止血之功。

本次研究比较了两种制备方法提取的紫癜方对ITP模型小鼠的治疗作用。结果发现，实验结束时紫癜水提组和紫癜工艺组小鼠血小板计数较血美安组小鼠明显升高，但是较醋酸泼尼松组小鼠明显降低，仍然没有恢复到正常水平;紫癜水提组和紫癜工艺组小鼠血小板计数比较没有显著性差异。提示紫癜方的水提取物具有升高ITP模型小鼠血小板的作用，这一结果与本课题组以往的研究一致，紫癜汤可以升高ITP模型小鼠血小板数[3]，紫癜颗粒能够提升血小板数量，但是作用相对缓慢[4]。本实验还发现，对紫癜方采用水提结合醇提的制备方法获得的提取物也可以升高ITP模型小鼠血小板数，而且两种方法制备的提取物升血小板的作用没有差异。所以提示我们为了提高紫癜方对ITP模型小鼠的治疗作用，需要进一步实验寻找合适的制备方法。

【参考文献】

[1]杨宇飞，周霭祥，麻柔.免疫性血小板减少性紫癜动物模型的建立[J].中华血液学杂志，1994，15(4)：160162.

[2]富琦.芪龙调血方治疗免疫性血小板减少性紫癜疗效与机制研究[D].北京中医药大学博士论文，2005.

[3]李杨.紫癜汤干预ITP小鼠处方优化和模型证属性的研究[D].辽宁中医药大学博士论文，2007.

[4]范颖.紫癜颗粒对ITP模型小鼠免疫调控的机理研究[D].北京中医药大学博士论文，2004.