降糖孜亚比提片的药效学研究

作者                       作者单位

李桂荣           新疆医科大学第一附属医院药学部

骆新             新疆医科大学第一附属医院药学院

毛新民           新疆医科大学第一附属医院药学院

据流行病学调查，目前全球糖尿病患者总数已逾1亿，其中90%左右为2型糖尿病(T2DM)。2型糖尿病是由遗传和环境　因素相互作用而引起的临床综合征，其发病机理为胰岛素抵抗为主伴有胰岛素分泌缺陷，或胰岛素分泌缺陷为主伴胰岛素抵抗和肝脏葡萄糖产生增加。2型糖尿病是一种慢性进行性疾病，持续的高血糖会导致许多并发症的产生，如视网膜、肾脏、神经系统病变及血管并发症。血管并发症是糖尿病患者致残致死的主要原因，因此保持接近正常范围的血糖水平对于预防糖尿病并发症十分重要[1]。降糖孜亚比提片(HZT)在临床上用于治疗糖尿病疗效显著，本课题采用给Wistar大鼠灌胃高脂乳剂，诱导出胰岛素抵抗，再结合两次给药法腹腔注射四氧嘧啶(ALX)，建立类似于人类T2DM的大鼠模型，从整体动物方面考察对T2DM大鼠血糖和血脂的影响，并对其进行了急性毒性试验，较全面地进行了HZT的药效学研究。

1材料与方法

1.1仪器罗氏Advantage优越Ⅱ型血糖仪及其试纸(瑞士罗氏公司);AL 204电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司);ACS-3Be电子计重秤(成都市汇通实业有限责任公司);TDL-5-A台式离心机(上海安亭科学仪器厂);DK-S 24型电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司); -20℃冰箱(AUCMA公司生产); Beckman-LX20全自动生化分析仪(美国贝克曼库尔特有限公司);XH-6020γ免疫计数器(西安二六二厂)。

1.2药品与试剂降糖孜亚比提片(新疆昌吉卫生学校实验中心提供);四氧嘧啶(ALX)(美国Sigma公司 A7413);短效胰岛素(江苏万邦医药生化有限公司); 50%葡萄糖(新疆制药厂);炼猪油(自己熬制);胆固醇(上海山浦化工有限公司);果糖(上海山浦化工有限公司);吐温-80(上海山浦化工有限公司);丙硫氧嘧啶(北京红惠生物制药股份有限公司);蔗糖(天津市福晨化学试剂厂);谷氨酸钠(国药集团化学试剂有限公司);丙二醇(天津市化学试剂三厂);血清胰岛素放射免疫测定试剂盒(深圳拉尔文生物工程技术有限公司)。

1.3实验动物健康雄性Wistar大鼠，体重(200±20)g;昆明种小白鼠，雌雄兼用，体重(20±2)g，均由新疆医科大学动物实验中心提供(医动字：第16-003号)，标准饲养环境，自由饮食。

1.4方法

1.4.1HZT的急性毒性试验取昆明种小白鼠20只，雌雄各半，进行HZT的急性毒性试验[2]，测得其最大耐受量为16.24 g/kg，是人用量(0.03 g/kg)的540倍，说明该药无明显毒性，安全性较好。

1.4.2体内实验

1.4.2.1高脂乳剂的成分及制备将炼猪油20 g、丙硫氧嘧啶1 g、胆固醇10 g、谷氨酸钠1 g、蔗糖5 g、果糖5 g、吐温-80 20 ml、丙二醇30 ml加水定容至100 ml，即配制成均匀的高脂乳剂。

1.4.2.2Wistar大鼠胰岛素抵抗性的判定

1.4.2.2.1实验分组 取Wistar大鼠20只，随机分为正常组和高脂组，每组10只。正常组大鼠每天灌胃纯净水，高脂组大鼠灌胃高脂乳剂，共计10 d。2组均是标准饲料喂养。

1.4.2.2.2采用毛细管法测胰岛素敏感性[3]大鼠禁食(不禁水)过夜后称重，固定于鼠笼中，测定第1次血糖后，立即腹腔注射短效胰岛素0.05 U/kg，再每3分钟用血糖仪测定血糖6次。以时间为横坐标，血糖的自然对数为纵坐标，直线回归所得回归系数(γ)代表直线斜率，γ×100即KITT值(胰岛素敏感性指数)。KITT值越小，说明机体对胰岛素越不敏感。

1.4.2.3T2DM大鼠模型的建立Wistar大鼠80只，其中8只作为正常组，标准饲料喂养10 d;72只Wistar大鼠灌胃高脂乳剂10 d，禁食(不禁水)，过夜、称重，按两次给药法[4]腹腔注射四氧嘧啶(ALX)。具体操作方法为：第1次腹腔注射3% ALX溶液(临用前在冰浴下用生理盐水新鲜配制)，第2次腹腔注射2.5% ALX溶液(同上)。注射容积为0.2ml/kg，连续2 d。正常组给予相应体积的生理盐水腹腔注射。采用罗氏血糖仪测定末次给药后72 h的空腹血糖(FBG)，以FBG≥11.1 mmol/L者定为T2DM模型大鼠。

1.4.2.4HTZ对T2DM模型大鼠的FBG及血脂的影响

1.4.2.4.1分组及给药根据组间FBG<1～2 mmol/L的原则分为：T2DM模型组给予20 ml/kg纯净水灌胃，HZT低、中、高　　剂量组分别给予220 mg/kg、440 mg/kg、880 mg/kg HZT灌胃，阳性对照组给予420 mg/kg消渴丸灌胃(XKP组);正常对照组给予20 ml/kg纯净水灌胃。各组每天灌胃1次，连续给药9周，且均以标准饲料喂养，自由饮食。

1.4.2.4.2T2DM模型大鼠FBG的动态变化规律及HTZ对其影响对T2DM模型大鼠不再给予高脂乳剂灌胃，而与对照组一样以标准饲料喂养。观察模型组大鼠FBG的动态变化规律，并于每周末次给药后观察T2DM大鼠FBG的动态变化。

1.4.2.4.3观察指标及检测方法各组大鼠禁食12 h，末次给药2 h后，称重，测定大鼠空腹血糖(FBG)后，摘眼球取血，3 000 r/min离心30 min,立即分离血清。Beckman-LX20全自动生化分析测定大鼠的血清胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)。采用XH-6020γ免疫计数器测定大鼠空腹血清胰岛素(FINS)水平。计算胰岛素分泌指数(IS)、胰岛素敏感指数(ISI)，IS=FINS/FBG,ISI=1/(FBG×FINS)[5]。

1.4.2.4.4各组大鼠胰腺的组织形态学观察将取完血的大鼠脱颈椎处死，立即解剖，取胰腺组织，以10% 甲醛溶液固　　定，石蜡包埋、切片，HE染色，光镜下观察其组织形态学的变化，并拍摄照片。

1.5统计学处理SPSS11.5统计软件包进行统计分析,实验数据以均数±标准差(±s)表示，两样本均数比较采用t检验　，方差不齐时两样本均数采用t′检验,检验水准α=0.05。

2实验结果

2.1Wistar大鼠胰岛素抵抗性的判定与正常组相比，高脂组大鼠的FBG无明显变化。但毛细管法检测结果表明：正常对　照组KITT值为(5.8±0.5)，高脂组大鼠KITT值为(2.8±0.9)，高脂组大鼠KITT值明显降低(P<0.01)，说明高脂组大鼠对胰岛素的敏感性降低(即产生了胰岛素抵抗)。

2.2T2DM模型大鼠胰腺组织病理学变化病理结果显示：与正常组相比，T2DM模型组大鼠胰腺组织结构散乱，胰岛细胞数目减少伴萎缩，部分β细胞胞浆内颗粒致密程度降低，呈现透亮，但无淋巴细胞浸润。与模型组相比，HZT中剂量组大鼠的胰岛数目增多，大小不一，部分β细胞体积增大，胰腺组织结构趋于完整;HZT低剂量组大鼠的胰岛形状不规则，β细胞数目有所增加，腺泡有部分嗜酸性变(图1～5)。图1正常组大鼠胰腺组织(HE ×400)图2模型组大鼠胰腺组织(HE ×400)图3HZT中剂量组胰腺组织(HE ×400)图4HZT低剂量组胰腺组织(HE ×400)图5阳性对照消渴丸组(HE ×400)

2.3T2DM模型大鼠FBG的动态变化规律 连续9周监测正常组和模型组大鼠FBG，发现T2DM模型大鼠FBG变化呈现一定的规律性。模型组由第1周开始FBG持续升高，第3周时下降到最低值(但FBG>11.1 mmol/L)，随后几周FBG继续回升，虽有较小波动，但基本保持在17.0～20.9 mmol/L之间，说明该模型的FBG相对保持稳定。在第1～9周内2组FBG差异均有统计学意义(P<0.01～0.05),见表1。表1T2DM模型大鼠FBG的动态变化

2.4HTZ对T2DM模型大鼠动态FBG的影响与正常组比较，在第1～9周内模型组FBG明显升高(P<0.01);与模型组比较，　　从第5周起HZT中剂量组FBG明显降低(P<0.05);在第7周和第9周时HZT低剂量组FBG明显降低(P<0.05)，差异具有统计学意义。XKP组从第7周起FBG降低较明显,见表2。表2HTZ对T2DM模型大鼠动态FBG的影响

2.5HTZ对T2DM模型大鼠血脂的影响与正常组比较，模型组的TG水平明显升高，FINS、IS、ISI明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05);与模型组比较，HTZ 中剂量组和低剂量组TC明显降低，FINS和IS升高，差异均有统计学意义(P<0.01～0.05);XKP组和模型组相比，FINS和 IS升高(P<0.01～0.05),见表3。表3HTZ对T2DM模型大鼠血脂的影响

2.6HTZ对T2DM模型大鼠FINS的影响与正常组比较，T2DM模型组大鼠的FINS水平明显降低(P<0.01);与模型组比较，　　HTZ 中剂量组和XKP组FINS水平显著提高，差异具有统计学意义(P<0.01)。

3讨论

胰岛素抵抗是T2DM发病机制的基本环节和显著特征之一，表现为胰岛素敏感性降低和胰岛素反应性降低[6]。有关资料表明，高脂饮食是T2DM及胰岛素抵抗综合征发病的重要因素[7]。很多学者的研究已证实，链脲佐菌素(STZ)注射和高热量饲料喂养是形成T2DM模型的重要条件[8-9]。但以STZ造模成本较高，本研究选用了较为经济的ALX注射。

降糖孜亚比提片(Hypoglycemic Ziyabiti Tablet，HZT)是新疆维吾尔医院根据民间治疗糖尿病验方研制而成，由欧玉竹、药喇叭根、鹿茸、马齿苋子、人参、石榴皮、竹黄、香茅、葫芦子、西黄蓍胶等十味药材组成。它具有调节胆液质、生津止渴的作用，在维吾尔医学上用于消渴症引起的尿多、烦渴、疲乏、消瘦等糖尿病症状。据《维吾尔药志》记载，香茅全草含降血糖类胰岛素样物质[10];玉竹甲醇提取物对肾上腺素所致的高血糖小鼠的血糖值有明显降低作用，并显示有改善耐糖功能的倾向[10]。另有文献报道，玉竹提取物还可对正常及链尿佐菌素(STZ)诱发高血糖小鼠均有降血糖作用[11]。人参水提液能有效降低实验性糖尿病大鼠的血糖含量[12];人参总皂甙对四氧嘧啶及STZ引起的大鼠实验性高血糖均有降低作用，而且其降血糖作用呈明显的量效关系[13];人参多肽对肾上腺素、四氧嘧啶及葡萄糖所致高血糖均有抑制作用[14];人参多糖对实验性高血糖症亦有降低作用[15]。有实验表明，马齿苋水煎剂对正常小鼠、四氧嘧啶糖尿病小鼠及肾上腺素高血糖小鼠均有明显的降血糖作用[16];马齿苋粗制剂还能明显改善2型糖尿病大鼠糖代谢异常[17]。首先给Wistar大鼠灌胃高脂乳剂，以保证其每天脂肪摄入量的均衡性，又用毛细管法测胰岛素敏感性，证实其产生了胰岛素抵抗。在此基础上，再按两次给药法给大鼠腹腔注射ALX，诱发其产生高血糖症。为降低大鼠成模前的死亡率，预实验中给大鼠腹腔注射了短效胰岛素，结果发现其可抑制大鼠诱发高血糖症。推测可能是因胰岛素用量较大，且注射时间过早，间接地对大鼠胰岛β细胞起了保护作用，但其具体原因还有待进一步的研究。本实验在高血糖期给大鼠少量多次灌胃饮用水，促进其排尿，以防止因酮症酸中毒而死亡;在低血糖期灌胃给25%葡萄糖溶液，防止因血糖过低而引起动物惊厥死亡。为监测成模后T2DM模型大鼠FBG的稳定性，本实验连续9周观察其血糖动态变化情况。结果发现：T2DM模型大鼠FBG在第1～9周内具有波动性，但基本保持稳定。因此，在用T2DM模型大鼠作抗糖尿病药物药效学研究时，应考虑到给受试药的时程长短，为增强说服力，给受试药的时间以4～9周比较合适。本研究连续9周给药，观察了HZT对T2DM模型大鼠FBG、TC、TG、HDL-C、FINS、IS、ISI等生化指标的影响。因HZT高剂量组大鼠的FBG始终未降下来，所以在进行结果统计时未将它列入其中。T2DM模型大鼠的体内实验结果表明：220mg/kg 和440 mg/kg HZT能降低T2DM模型大鼠FBG、TC，能提高HDL-C;440 mg/kg HTZ和420 mg/kg XKP可提高大鼠FINS水平;220 mg/kg HZT、440 mg/kgHZT和420 mg/kg XKP均可使IS增加。各组TG比较差异没有统计学意义。HZT的急性毒性试验结果表明，该药无明显毒性，安全性较好。通过对HZT体内实验结果分析，推测其降血糖的机制可能是通过促进胰岛素分泌、增加细胞对葡萄糖的利用而起作用的。

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