多药效学指标评价乌鳖颗粒中黄狗肾提取工艺

作者                             作者单位

陈武                   南京中医药大学,江苏 南京 210029

周洪亮                 南京中医药大学,江苏 南京 210029

王海丹                 南京中医药大学,江苏 南京 210029

刘志辉                 江苏省中医院,江苏 南京 210036

乌鳖颗粒来源于江苏省中医院名老中医夏桂成教授临床经验方,由黄狗肾、制何首乌和鳖甲等7味药组成,临床上用于治疗卵巢功能早衰。黄狗肾为犬科动物狗Canis familiaris L.的干燥阴茎和睾丸,具有暖肾、壮阳、益精功效[1]。目前黄狗肾文献报道比较少,物质基础研究薄弱,有效成分尚不明确,为保证制剂疗效,笔者采用多药效学指标评价方法对黄狗肾提取工艺进行探索。

1 实验材料

1.1 动物

雌性SD大鼠,体重120～140 g,由浙江大学实验动物中心提供,动物合格证号：SCXK(浙)2008-0033。ICR小鼠,体重14～18 g,由扬州大学实验动物中心提供,动物合格证号：SCXK(苏) 2007-0001。

1.2 仪器

SP-756PC型紫外可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司);LDZ5-2型离心机(北京京立离心机有限公司);r-911全自动放免计数仪(中国科技大学实业总公司);FA1004电子分析天平(上海精科天平厂)。

1.3 药物与试剂

六味地黄丸(河南宛西制药股份有限公司,批号090872)。黄狗肾及方中饮片均购于江苏省医药公司,经鉴定符合相关要求。红四氮唑(TTC,上海试剂三厂,批号961115);四氯乙烯(中国医药集团上海化学试剂公司,批号20010203);无水乙醇(上海久亿化学试剂有限公司,批号20090210)。雌二醇(E2)试剂盒(北京华英生物技术研究所,批号20091128);促卵泡激素(FSH)试剂盒(北京华英生物技术研究所,批号20091128);黄体生成素(LH)试剂盒(北京华英生物技术研究所,批号20091128)。

2 方法与结果

2.1 供试液制备方法

工艺A提取液：按处方比例称取饮片,黄狗肾加10倍量95%乙醇回流提取2次,每次1 h,滤过,药液与药渣备用;枸杞子、茯苓加10倍量水煎煮2次,每次1 h,滤过,合并滤液,浓缩至相对密度为1.20(60 ℃测)的浸膏,备用;黄狗肾药渣与方中其他饮片加10倍量水煎煮2次,每次2 h,滤过,合并滤液,浓缩至相对密度1.15(80 ℃测),加乙醇至含量为60%,静置48 h,抽滤,滤液与黄狗肾液合并回收乙醇至尽,再与枸杞子、茯苓提取液合并即得。

工艺B提取液：按处方比例称取饮片,黄狗肾加10倍量70%乙醇回流提取2次,每次1 h,滤过,药液与药渣备用;其余6味饮片的处理同工艺A。

阳性对照液：取六味地黄丸捣碎,研成粉状,然后加入蒸馏水混溶,即得。

阴性对照液：按处方比例称取饮片(缺黄狗肾),饮片的处理同工艺A。

2.2 统计学方法

数据用—(—用)±s表示,采用t检验,用SPSS11.0统计软件进行统计分析。

2.3 对卵巢摘除大鼠雌激素活性的影响

取雌性SD大鼠85只,除正常对照组10只外,其余75只去除双侧卵巢,手术后2周,将手术成功的大鼠随机分组,每组10只。各组按下述剂量每日灌胃给予相应药物1次,正常对照组和模型组：等量生理盐水;阳性对照组：3 g/kg六味地黄丸;工艺A组：11 g/kg;工艺B组：11 g/kg;阴性对照组：11 g/kg。每日灌胃1次,连续给药4周。末次给药30 min后,每鼠阴道内缓缓注入新鲜配制的25 mg/mL TTC水溶液0.1 mL,于阴道内停留30 min,取血,离心,取血清测E2、FSH、LH水平。立即处死,剪取大鼠阴道,纵行切开,分离阴道,剪碎后置离心试管中,加入无水乙醇和四氯乙烯混合溶液4 mL,浸泡提取2 h, 2 000 r/min离心5 min。吸取上清液,以无水乙醇和四氯乙烯混合液作空白对照,于490 nm处测定A值[2-4]。

结果表明,工艺A组和工艺B组均可使卵巢摘除大鼠血清E2水平增高,与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)。提示工艺A组和工艺B组具有调节机体激素水平的作用。工艺A组的OD值与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01),提示工艺A组可明显增加大鼠阴道角化上皮细胞,具有提高雌激素活性的作用。见表1、表2。表1 对卵巢摘除大鼠血清E2、FSH、LH活性的影响(—(—的)±s)表2 对卵巢摘除大鼠雌激素活性的影响(—(—巢)±s)

2.4 对幼鼠子宫、卵巢发育的影响

取未成熟ICR健康雌性幼鼠(体重14～18 g)60只,随机分为空白对照组(灌胃等量生理盐水)、阳性对照组(4.5 g/kg)、工艺A组(16.5 g/kg)、工艺B组(16.5 g/kg)、阴性对照组(16.5 g/kg)。各组均灌胃给予相应药物,剂量0.2 mL/10 g, 1次/d×10 d。末次给药后12 h,脱颈椎处死,解剖,取子宫、卵巢、脾、胸腺,分离脂肪,迅速以电子天平称重。计算脾、胸腺、卵巢、子宫系数 [2]。结果表明,工艺A组促进子宫、卵巢和胸腺生长,与空白组比较差异有统计学意义(P<0.05)。提示工艺A组具有促进子宫、卵巢发育的作用。见表3。　表3 对幼鼠子宫、卵巢、脾、胸腺发育的影响(—(—鼠)±s)

3 讨论

鞭类中药饮片的服用方法主要包括研粉吞服、煮食和泡酒内服。谭氏等[5]研究结果表明,狗鞭(黄狗肾)饮片匀浆后的混悬液对肾阳虚型动物有不同程度的壮阳作用;文献报道其主要含雄性激素、蛋白质、维生素E、脂肪和有机纤维等成分[6]。

本试验结果表明,乌鳖颗粒中黄狗肾不同乙醇浓度提取工艺(工艺A和工艺B)的提取物均可使卵巢摘除大鼠血清E2水平增高;此外,用95%乙醇提取工艺(工艺A)制备的提取物还具有较好的提高大鼠雌激素活性,促进子宫、卵巢生长的作用,这与乌鳖颗粒治疗卵巢功能早衰目的一致。综合上述分析,方中黄狗肾饮片应用95%乙醇提取。

提取黄狗肾所用乙醇浓度不同,对药效的影响也不同,浓度高者药效明显好,这是否提示黄狗肾中极性较低的成分是其有效成分,有待进一步研究。

【参考文献】

[1] 江苏省卫生厅.江苏省中药饮片炮制规范[M].南京：江苏科学技术出版社,1992.443.

[2] 李仪奎.中药药理实验方法学[M].上海：上海科学技术出版社,2006.836.

[3] 张军武.归肾丸对大鼠卵巢早衰防治作用的实验研究[J].中国现代医药杂志,2008,10(6)：79-80.

[4] 戚本明,戚本玲.葛根提取物对正常及去势大鼠血清雌激素水平影响的研究[J].中国中药杂志,2002,27(11)：850-851.

[5] 谭兴贵,曾 嵘,贺福元.鹿鞭、狗鞭、牛鞭的壮阳作用实验研究[J].中医药学报,2001,29(6)：33-34.

[6] 窦立院.介绍柴狗肾[J].中药饮片,1993,(1)：32-33.