高效液相色谱法研究复尔康注射液在家兔体内的药动学特征

作者                        作者单位

刘明华                泸州医学院药理学教研室

肖顺汉                泸州医学院药理学教研室

何兵                  泸州医学院药物研究所，四川 泸州 646000

冯文宇                泸州医学院药物研究所，四川 泸州 646000

章卓                  泸州医学院药理学教研室

李蓉                  泸州医学院药理学教研室

李茂                  泸州医学院药理学教研室

任美萍                泸州医学院药理学教研室

复尔康注射液是泸州医学院药物研究所研制的多相脂质体注射液，由维A酸、甘草酸铵和青蒿油组成，药效学试验表明，该制剂具有抗肝癌、肺癌、白血病的作用。本研究建立了一种快速的高效液相色谱法(HPLC)，可同时测定复尔康注射液中维A酸和甘草酸铵的血药浓度和药动学参数，为该药的药效学及临床应用提供理论和剂量参考。

1 材料与方法

1.1 动物 家兔6只，日本大耳白，雌雄各半，体重1.5-2.0 kg(泸医实验动物科提供，生产许可证：医动字17号)

1.2 试剂 复尔康注射液(含维A酸1 mg·ml-1，甘草酸铵2 mg·ml-1)和维A酸注射液(含维A酸1 mg·ml-1)，由泸州医学院药研所冯文宇提供。剂量设计：根据委托方的实验要求，确定复尔康注射液的剂量为8ml·Kg-1(含维A酸5.68mg·Kg-1，甘草酸铵12.8mg·Kg-1)。甘草酸铵对照品(110731-200409)、维A酸对照品(100307-200401)，中国药品生物制品检定所提供。乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为重蒸馏水。

1.3 仪器 戴安高效液相色谱仪(P680A四元低压梯度泵，PDA-100二极管阵列检测器，TCC-100柱温箱，Chromeleon色谱工作站);瑞士Precisa电子天平(XR 205SM-DR)。

1.4 方法

1.4.1 色谱条件 色谱柱：Dikma Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5μm);流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脱，0 min为35∶65，20 min为80∶20，40 min为95∶5;检测波长：分段变波长测定，0～23min为252 nm，23～40min为355 nm;柱温：30℃;流速：1.0 ml·min-1;进样量：20μl。

1.4.2 试液的制备

1.4.2.1 对照品溶液 取甘草酸铵、维A酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加空白血浆0.5 ml，以80%异丙醇稀释制成每1 ml分别含甘草酸铵100.68μg、维A酸1.97μg的混合溶液，即得。

1.4.2.2 血浆样品的处理 取待测血浆0.5 ml，加入异丙醇2 ml，充分震摇，1500 r·min-1离心10 min，取上清液，进样20 μl。

1.4.3 专属性 将空白血浆、对照品+空白血浆及血浆样品的色谱图进行比较。

1.4.4 线性范围取甘草酸铵和维A酸对照品适量，精密称定，加入空白兔血浆0.5ml，以异丙醇稀释制成每1ml含甘草酸铵1～200μg、维A酸0.05～2μg的溶液，1500r· min-1离心10min，进行HPLC测定。

1.4.5 回收率 取空白兔血浆0.5ml，加分别含甘草酸铵200μg· ml-1和维A酸2μg· ml-1对照品溶液0.25、0.5、0.75ml，以异丙醇稀释至2ml，制成低、中、高3种浓度的溶液，1500 r·min-1离心10min，取上清液，测定甘草酸铵和维A酸的峰面积，带入标准曲线计算其回收率。

1.4.6 精密度试验 取空白兔血浆0.5ml，精密加入适量甘草酸铵和维A酸对照品适量，使甘草酸铵浓度分别为50、100、150μg· ml-1，维A酸的浓度分别为0.5、1、1.5μg· ml-1，充分震摇，1500r·min-1离心10min，取上清液，进样测定，计算日内和日间(10 d内)精密度。

1.4.7 稳定性试验 取待测血浆样品溶液，置-20 ℃冰箱中，分别于0和30 d取出，按样品预处理和测定方法操作，对0和30 d的测定结果进行t检验

1.4.8 药动学参数测定[1] 家兔6只，分2组，每组3只，作为复尔康组和维A酸组，分别耳缘注射复尔康注射液和维A酸溶液8 ml·kg-1，于注射后5、10、20、40、60、90、120、180、240 min 心脏取血1ml，置离心管中加入1ml三氯乙酸和1ml异丙醇，3000 r·min-1离心15 min,取上清液0.5ml，取20ul进样。

2 结果

2.1 专属性 甘草酸铵的保留时间为7.6 min，维A酸的保留时间为32.1 min，结果显示无内源物质的干扰。见图1。

2.2 线性范围 以甘草酸铵和维A酸峰面积A对进样量C(μg)进行回归，得标准曲线方程：

甘草酸铵：A=11.6375 C-0.0826，r=0.9998;

维A酸：A=122.2576 C-0.0682，r=0.9996。

结果表明，甘草酸铵在0.02～4μg范围内，维A酸在0.001～0.04μg范围内，峰面积与进样量有良好的线性关系。当S/N=10时，甘草酸铵和维A酸的定量限分别为1.5、0.2 ng。

图1 HPLC色谱图

A：血浆+对照品;B：样品;C：空白血浆;1：甘草酸铵;2：维A酸

2.3 回收率甘草酸铵和维A酸的峰面积，带入标准曲线计算其回收率，三种浓度下的回收率分别为97.82、99.07、98.18%和98.56、97.94、97.05%。

2.4 精密度试验日内、日间RSD均小于3%(n=5)

2.5 稳定性试验0和30 d的测定结果差异无统计学意义，说明药物在血浆中在-20 ℃保存条件下至少可稳定1个月。

2.6 药动学参数测定 结果显示，复尔康注射液中的维A酸和甘草酸铵及维A酸注射液的药-时曲线见图2和图3。根据F检验和AIC值确定复尔康注射液中维A酸和甘草酸铵及维A酸注射液在家兔体内均呈现典型的开放二室动力学模型特征，其药动学参数见表1。

3 讨论

本研究分别采用甲醇、乙醇和异丙醇除蛋白质，结果发现异丙醇效果极佳，且异丙醇对维A酸的溶解度也好，故最后选定异丙醇除蛋白质，同时也作为提取溶剂。采用二极管阵列检测器在190～380 nm范围内分别扫描混合对照品溶液中甘草酸铵和维A酸峰的紫外吸收。结果甘草酸铵在252 nm左右处有最大吸收，维A酸在355 nm有最大吸收。为使测定甘草酸铵和维A酸均在其最大吸收波长下进行测定，以提高分析方法的灵敏度，采用分段变波长检测法对此2种化学成分进行测定，根据各成分保留时间差异，在0～33 min设定检测波长252 nm，以测定甘草酸铵，在23～40 min设定检测波长355 nm以测定维A酸。表1 复尔康注射液及维A酸注射液的药动学参数

本研究考察了单独分离甘草酸铵和维A酸的常用流动相：甲醇-冰醋酸溶液[2-3]、甲醇-磷酸溶液[4]、乙腈-冰醋酸溶液[6]和乙腈-磷酸溶液[7]的不同比例、梯度、pH值、流速及柱温。结果发现流动相以乙腈-0.1%磷酸溶液作线性梯度洗脱，0 min为35∶65;20 min为80∶20;40 min为95∶5;流速为1 ml·min-1，柱温为30 ℃时分离效果最理想，基线波动较小，故采用此流动相。

HPLC简便、快速、灵敏度高、重现性好，可同时检测复尔康注射液中维A酸和甘草酸铵的血药浓度。结果显示复尔康注射液中维A酸和甘草酸铵及维A酸注射液在家兔体内均呈现典型的开放二室动力学模型特征。与维A酸注射液比较，t1/2 alpha和t1/2 beta延长，AUC增大,揭示复尔康注射液中维A酸在体内的消除减慢,生物利用度增加。K10明显减缓，而K21 和K12无明显变化，表明复尔康注射液中维A酸自中央室的消除明显减缓，药物向组织分布的量增加。CL显著降低，表明复尔康注射液中维A酸在家兔体内的循环时间延长了1倍。

【参考文献】

1 孙洁胤,周芝芳,刘放,等. 苦参素固体脂质纳米粒的药动学和体内分布[J]. 中国药学杂志, 2007, 42(14): 1091-1095.

2 国家药典委员会. 中国药典, 二部[S]. 北京: 化学工业出版社, 2005: 662-663.

3 王福霞,冯文菊,姜武民. HPLC法测定维A酸与异维A酸含量[J]. 药物分析杂志, 2007, 27(4): 585-587.

4 于美丽,方淑昌,陆伟,等. HPLC法测定血清中全反式维甲酸浓度[J]. 中华临床医药, 2004, 5(19): 113-114.