放射性核素示踪法对多肽VEGF125-136在家兔体内的药代动力学研究

作者                        作者单位

黄定德          第三军医大学西南医院核医学科,重庆400038

罗朝学          第三军医大学西南医院核医学科,重庆400038

刘广元          第三军医大学西南医院核医学科,重庆400038

郑磊            第三军医大学西南医院核医学科,重庆400038

陈杰            第三军医大学西南医院核医学科,重庆400038

李前伟          第三军医大学西南医院核医学科,重庆400038

程绍钧          第三军医大学西南医院核医学科,重庆400038

血管内皮细胞生长因子VEGF能促进血管生成,在肿瘤的生长过程中发挥重要作用,而VEGF165外显子6编码的某些短肽能特异地与VEGFR结合,但不发挥生物学活性,从而竞争拮抗VEGF的促血管生成作用,所以该类短肽有望作为肿瘤特异的靶向显像或治疗的候选药物[1]。本研究运用间接标记法对VEGF125-136 (氨基酸序列QKRKRKKSRYKS,为VEGF165外显子6编码的短肽)进行放射性核素99Tcm标记,以探讨VEGF125-136在正常家兔体内的药代动力学,为VEGF125-136的肿瘤显像奠定一定基础。

1　材料与方法

1. 1　VEGF125-136的合成及与MAG3的偶联

目前国内外多先采用二步法合成NHS-MAG3[2],再将NHS-MAG3与多肽末端的氨基连接,形成多肽-MAG3复合物,步骤繁琐且费用较高。我们在北京中科亚光科技有限公司的协助下,在合成VEGF125-136过程中直接在其N端连接3个甘氨酸,并对N端的甘氨酸进行乙酰化巯基乙酸修饰[3]。即在多肽VEGF125-136的合成过程中直接完成与MAG3的偶联,得到VEGF125-136-MAG3。产物纯度达98. 0%。

1. 2　VEGF125-136-MAG3的99Tcm标记

参照文献[ 2, 4 ]方法,略作改进。标记缓冲液为0. 25 mol/L的NaHCO3, 0. 18 mol/L氨水, 0. 125 mol/L醋酸铵混合液,反应总体积125μ,l多肽含量20μg,99TcmO4淋洗液(凝胶型99Mo-99Tcm发生器,中核高通同位素股份有限公司提供)的放射性活度为37 MBq,经正交设计得出最佳标记条件为: 25℃、pH 7. 6,反应时间30 min,转鳌合剂酒石酸钾钠的终浓度为3. 5μg/μ,l SnCl2用量为5μg/μl。在此条件下,标记率约为78%。

1. 3　标记物的纯化

标记物采用HPLC法纯化, C18柱,BufferA为0. 15% TFA+10% ACN;BufferB为0. 10% TFA+90% ACN,波长210 nm,上样量为50μl。纯化后放射化学纯度达97%以上。

1. 4　药代动力学实验

1. 4. 1　取6只雄性日本大耳兔(体质量2. 1~2. 3 kg,第三军医大学实验动物中心提供),每只经耳缘静脉注入99Tcm-VEGF125-136-MAG337MBq,分别于注射后1·5、3·0、5·0、10、30、60、90、120、180、240 min从对侧耳缘静脉采血0. 2 m,lγ-免疫计数仪(GC-911型,中佳光电仪器公司)测量其放射性计数率(cpm), cpm经衰减校正后除以γ-免疫计数仪的探测效率换算成放射性浓度(即kBq/L血液)。

1. 4. 2　药代动力学参数计算

应用药物代谢动力学分析软件(DAS 2. 0),以放射性浓度替换软件中药物浓度,对6只兔的平均血液放射性浓度-时间数据分别进行一、二、三室模型曲线拟合,并以1、1/C和1/CC作为权重系数(C为血液放射性浓度实测值)对各时相点血液放射性浓度残差平方和作加权处理,以F检验、AIC值、R2值为依据,对房室模型进行综合分析、判断,并计算药代动力学参数。

2　结果

2. 1　最佳房室模型的判别

将6只动物的平均放射性浓度及其对应的时间等数据输入药代动力学分析软件(DAS 2. 0),绘制平均放射性浓度-时间曲线(图1),并用该软件进行数据拟合,以AIC、拟合度(R2)为判定指标进行模型识别[5-8],结果见表1、2。

表1　不同权重数各室模型的AIC和R2值

1 1/C 1/CC

权重

AIC R2AIC R2AIC R2

一室模型172. 294 0. 943 83. 937 1. 000 3. 624 1. 000

二室模型153. 137 0. 994 73. 967 1. 000 -14. 757 1. 000

三室模型151. 479 0. 997 59. 250 1. 000 -28. 159 1. 000

图1　99Tcm-VEGF125-136-MAG3在家兔体内的时间-

放射性浓度曲线(n=6)

表2　不同权重数各室模型的比较

权重房室F值P值

1 1∶2 4. 566 <0. 05

2∶3 121. 566 <0. 05

1/C 1∶2 6. 701 <0. 05

2∶3 48. 110 <0. 05

1/CC 1∶2 25. 126 <0. 05

2∶3 9. 396 <0. 05

从表1及表2可知:三室模型、权重1/CC最佳,二室模型、权重1/CC次之。表明VEGF125-136在家兔体内的药代动力学过程呈三房室开放模型,以权重1/CC计算的药时曲线拟合最佳。

2. 2　VEGF125-136在家兔体内的药代动力学参数

通过室模型判别表明VEGF125-136在正常兔体内的药代动力学过程符合权重为1/CC的三室模型。以三室模型的基本数学式C(t)=Ae-αt+Be-βt+Ce-γt进行曲线拟合得到如下血液放射性浓度-时间曲线关系:

C(t)=151.06e-0.668t+55.70e-0.028t+9.95e-0.003t

式中C为血液放射性浓度(kBq/ml),t为注射99Tcm-

VEGF125-136-MAG3后的时间(min )。计算得到99Tcm-

VEGF125-136-MAG3在正常兔体内的药代动力学参数,见表3。

表3　VEGF125-136-MAG3三室模型药代动力学参数(W =1 /CC)

房室参数-x±s

t1/2α(5. 327±2. 351) min

t1/2β(26. 446±6. 502) min

t1/2γ(304. 410±216. 811) min

V1 (110. 000±56. 000) ml

CL (4. 000±1. 000) ml·min-1

AUC(0-t) (4 347. 760±714. 650) kBq·ml-1·min-1

AUC(0-∞) (4 940. 820±818. 980) kBq·ml-1·min-1

K10 (0. 047±0. 034) min-1

K12 (40. 650±68. 540) min-1

K21 (0. 111±0. 058) min-1

K31 (0. 111±0. 058) min-1

K13 (0. 002±0. 004) min-1

1747　　3　讨论

放射性同位素标记技术因其灵敏度高,操作简便、快捷而成为研究蛋白多肽药物药代动力学常用的方法之一,本研究应用进行放射性核素99Tcm对小分子多肽VEGF125-136进行间接标记,并对标记产物进行HPLC纯化,放化纯度大于97%。

本研究显示:VEGF125-136在家兔体内的药代动力学行为符合三室开放模型,快速分布相α反映注入体内的放射性药物自血液(中央室)向组织细胞外液(周边室)分布的快慢,慢分布相β代表放射性药物从周边室向富含VEGF受体的组织器官(第3室)分布的速率,消除相γ代表体内放射性的消除速率,分布相半衰期t1/2α及t1/2β分别为5. 33、26. 45min,表明静脉注入的99Tcm-VEGF125-136-MAG3随血液循环迅速到达周边室,符合小分子多肽血液清除快的特点,有助于减少早期显像时心脏与大血管影的干扰,而且快速向

靶器官(第3室)转移。另外,消除相半衰期t1/2γ较长(304. 41 min),说明该多肽能快速到达靶器官且停留时间相对较长,保证了在病理情况下高表达VEGF受体的病变组织细胞与放射性核素标记的VEGF125-136有更多的结合几率,有利于发挥VEGF125-136介导的

核素显像或核素治疗作用,并有利于减少对其他组织器官的辐射影响。

VEGF受体特异地高表达于新生血管丰富的组织器官,针对VEGF受体设计的肿瘤显像或治疗药物正越越受到人们的重视。VEGF165外显子6编码的某些短肽能特异地与VEGFR结合,但可竞争拮抗VEGF的促血管生成作用,所以该类短肽有望作为肿瘤特异的靶向显像或治疗的候选药物。本实验显示VEGF125-136在血液中清除较快而在周边血管丰富的组织中停留时间较长,提示放射性核素标记的该药物用于核素显像时,能获得低血池本底及高质量对比图像;用于核素治疗时,有利于降低副反应。

参考文献:

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