清开灵的药理作用研究

作者                       作者单位

吴宏娟　　            哈药集团世一堂制药厂

1 材料与方法

1.1 实验动物 新生SD大鼠(出生24 h以内)由哈尔滨医科大学实验动物中心提供。

1.2 药物及试剂 清开灵哈尔滨远达药业有限公司生产(批号：080911)。L—谷氨酸(Glu)、多聚赖氨酸(poly—D—Lysine)、N—2—羟乙基哌嗪—N—2—乙磺酸(I PES)为美国Sigma公司产品。

1.3 仪器722光栅分光光度计，由上海第三分析仪器厂生产。

1.4 大鼠大脑神经细胞培养按文献[2]方法，无菌条件下分离新生鼠大脑皮层，切成0.5Ⅱm3碎块，置于含2.5 g•L 胰蛋白酶的Hank'8液中，37℃消化15 min，加入含200 mL•L 小牛血清的DMEM培养基中止消化。然后用移液管反复轻轻吹打组织，制成单细胞悬液。离心，200 g，5 min。弃上清，再用完全培养液重新悬浮细胞，调整细胞密度为1.0×106个/ml，接种在预先用poly-D-Lysine覆盖的35mm2平皿中，每皿种2mL。培养3～4d，改用含2.5mg/L阿糖胞苷的培养液培养24 h，以抑制胶质细胞的生长，再改用常规培养液培养。培养液由DMEM，200mL•L 小牛血清、2mmol/L 谷氨酰胺和21mmol/L 葡萄糖组成。细胞在37℃、含5%CO2和95%空气的混合气体中培养10～12d即可用于实验。培养过程中每周换液2次，每次更换50%培养液。

1.5 细胞毒性实验及清开灵的对抗作用实验 取培养10 d的神经细胞进行实验，实验共分4组：①正常对照组;② 损伤组;③清开灵小剂量组(10 mL•L-1);④清开灵大剂量组(20 mL•L-1)。每组设4皿。实验时，参照文献[3]方法，除正常对照组外，其余各组同时加入等量的低糖DMEM培养液和10 umol/L的谷氨酸;清开灵组在加谷氨酸前10 min，向培养液中加入不同浓度的清开灵。再将各组置于培养箱中培养8h后，镜检并取上清液测乳酸盐脱氢酶(LDH)活性。

1.6 观察指标 用倒置显微镜观察神经细胞的形态变化，以培养液上清中LDH活性作为定量评价细胞受损伤程度的指标。测定LDH时，参考文献[4]，先测培养液上清中LDH活性，然后将相应的培养细胞置于—30℃，3 h以上，使细胞破碎，再测总LDH活性。细胞损伤程度以培养细胞释放的LDH占总LDH活性的百分比表示。

1.7 LDH活性测定 按文献[5]进行。

2 结果

培养10 d后的神经细胞立体感强，胞体有明显的折光性，呈锥体、双极或多极形，细胞呈团聚集，分布疏密不均;细胞突起相互交织成网。损伤组中，大部分细胞折光度降低，胞体肿胀，神经元突起断裂，变短。培养液中LDH漏出率明显增加。但是，在加入Glu前加入清开灵分散片的两组细胞受损程度相对较轻，LDH漏出率较损伤组为低，与损伤组比较具有显著性差异;且高剂量组较低剂量组的形态学改变更轻一些，LDH漏出率更低，统计学检验也有显著意义(见表1)。表1 清开灵对Glu介导的神经细胞的LDH漏出率的影响注：与损伤组比较，*P<0.05

3 讨论

临床观察发现，清开灵对脑缺血大鼠皮层组织中的超微结构具有保护作用，能对抗脑缺血时自由基对脑组织造成的损伤。据报道，正常情况下，LDH是细胞内的一种标志酶，神经元内LDH含量丰富，且流出量极少，而当神经元受损后，随受损程度的加重，膜通透性增强，LDH流出相应增加。在10μml/L×Glu低糖培养液培养的条件下，神经元已形成了离体“缺血”模型[6]。Koh认为测定培养液中的LDH含量能够定量评价神经元的受损程度[7]。因此，我们以培养液中LDH的漏出率作为主要的观察指标。Glu浓度过高导致神经细胞损伤的机制可能在于，其作用于突触后膜上的NMDA(N—甲基—D—天冬氨酸)受体和非NMDA受体，钙离子通过NMDA受体偶联的钙通道和电压依赖性钙通道内流，使突触后神经细胞内钙超载以及自由基生成增多，导致细胞损伤，膜通透性增强，LDH大量外漏。

【参考文献】

1] 张桂芝，李锐，陈豪君.清热解毒药—清开灵的研究及其临床应用[J].新中医，1994，(3)：59-60.

[2] 洪庆涛，唐一鹏.新生大鼠大脑皮层神经细胞的体外原代培养[J].神经解剖学杂志，1994，10(3)：259.

[3] 裴林，纵艳艳，孙亚锋，等.谷氨酸对培养神经元的兴奋毒性及氯氨酮的保护作用[J].徐州医学院学报，1995，15(3)：221.

[4] 马丽焱，肖培根，梁发权，等.三七总皂苷大鼠皮层神经细胞的保护作用[J].中国药学杂志，1998，33(3)：143-144

[5] 赵善政.乳酸脱氢酶测定.见：临床生化检验[M].上海：上海科学技术出版社，1979.314.

[6] 裴林，纵艳艳，张光毅.氯胺酮和右美沙芬对培养神经元缺氧损伤的保护作用[J].徐州医学院学报，1996，16(4)：337.