氟尿嘧啶原料及注射液中有关物质的定性及定量分析

　　5一氟尿嚓陡(5一fluorouracil)是临床上常用的抗肿瘤药物之一，是目前胃、直结肠癌术后辅助化疗或晚期病人治疗中的首选药物。中国药典2010年版采用高效液相色谱不加校正因子的主成分自身对照法测定氟尿;陡原料及注射液中的有关物质。英国药典(BP2011)和欧洲药典(EP6.0)中氟尿嚓陡原料项下需要控制的有关物质有7种(见图1)，其中杂质A,B,C,D,E可采用液相色谱法进行测定，杂质D,G需采用薄层色谱法进行测定。BP2011对注射液中的有关物质用薄层色谱法进行了控制。国内虽有研究报道了氟尿A;A;中有关物质的测定方法，但是该研究中测定的有关物质不够全面。本研究根据有关物质的研究方法，并参考英国药典的测定方法51，对97批氟尿嚓陡注射液和2批原料中的有关物质进行了归属，采用标准曲线法进行了定量，并对各有关物质的校正因子进行了考察。
　　1仪器、试药与材料
　　WatersAllianceHT系统，Waters2487紫外检测器，Empower工作站;氟尿嚓陡对照品(中国食品药品检定研究院，扎E号:100187-200b02;巴比妥酸对照品(IA,Sigma一Aldrich公司，批号:EC2006580);5-经尿嘀陡对照品(IB,Fluka公司，批号:STBB6228);尿嚓咤对照品(IC，国药集团化学试剂有限公司，批号:F20091119);5一甲氧基尿嚓陡对照品(ID,Aldrich公司，批号:5173436);5一氯尿嚓咤对照品(IE,Aldrich公司，批号:04617AJV)o氟尿I;A原料(A药厂提供)，氟尿嚓陡原料(B药厂提供)，氟尿嚓咤注射液(A药厂);氟尿嚓陡注射液(B药厂);甲醇为色谱纯，试验用水为重蒸水，其他试剂均为分析纯。
　　2色谱条件
　　色谱柱:KromacilC,、柱(250mmx5mm,5N,m);流动相:甲醇一水(磷酸调pH为3.5)(5:95);流速:1.0mL·min;检测波长:265nm;柱温;35℃。
　　3溶液配制
　　3.I供试品溶液取本品适量，加流动相稀释成每1二0mL中约含氟尿嚓陡0.10mg的溶液，作为供试品溶液。
　　3.2对照品溶液
　　精密称取IA,IB,IC,IE对照品约5mg，分别置50mL棕色量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为各自的对照品储备液;精密称取ID对照品150mg置25mL棕色量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为ID的对照品储备液;精密量取各对照品储备液1.0mL置同一10mI量瓶中，逐级稀释为系列标准曲线溶液，其中每1mL约含IA,IB,IC,IE均约0.O1,g·mL和ID约0.6O,g}mL‘的溶液作为杂质混合对照品溶液。取IC对照品储备液1.0mI置10mL量瓶中，加人1mL供试品溶液，流动相稀释至刻度，作为系统适用性溶液。
　　精密称取氟尿嚓陡对照品10.0mg，置100mL棕色量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液，精密量取对照品储备液适量，用流动相逐级稀释为系列标准曲线溶液，其中每1mL约含氟尿嚓咤0.25},g·mL的溶液作为有关物质对照溶液。
　　4方法与结果
　　4.1专属性与系统适用性分别取空白溶液、样品溶液及系统适用性溶液20L，按“2”项下色谱条件，进样，记录色谱图(见图2一3)。结果可见，方法专属性较好，不含主成分的空白溶剂不干扰测定，由图2可见，IA,IB,IC,ID,IE与氟尿嚓陡色谱峰的分离度均达到要求;IC与氟尿嚓陡色谱峰的分离度大于3，符合实验要求。
　　4.2标准曲线的制备分别取杂质系列标准曲线溶液及氟尿嚓陡系列标准曲线溶液20},L，按“2”项下色谱条件，进样，记录色谱图。以峰面积积分值为纵坐标(Y)，各对照品的浓度为横坐标(X)，进行线性回归，其线性方程见表1。
　　4.3精密度试验精密量取杂质混合对照品溶液(每1mL含IA,IB,IC,ID,IE分别为0.0126,0.0138,0.0115,0.6013,0.0141},g·mL按“2”项下色谱条件连续进样5次，计算混合对照品溶液中各峰峰面积，其平均RSD均在2.5%以下，说明仪器精密度良好。
　　4.4重复性考察精密量取批号为1011072的供试品溶液适量，按“3.1”项下方法，制备J份供试品溶液，按“2”项下色谱条件操作，以标准曲线法计算杂质含量，IA,IB,IC,ID的含量分别为0.0082%,0.015%,0.0074%和0.2592%，杂质E未检出，5份样品中各杂质含量的RSD均在2.6%以下。
　　4.5回收率试验精密量取已知含量的批号为1011072供试品溶液适量，加人杂质混合对照品溶液(每1mL含IA,IB,IC}ID,IE分别为0.0126,0.0138,0.0115,0.6013,0.0141·mL)适量，按照“3.1”项下的供试品制备方法制备回收率样品溶液，按“2”项下色谱条件，进样分析，以标准曲线法测定并计算回收率，IA,IB,IC}ID,IE的平均回收率分别为9S.6%,96.8%,98.1%,99.1%,97.1%。
　　4.6校正因子的计算研究中对相关参考文献中校正因子的计算方法进行了分析，确定了各杂质相对于氟尿P陡的校正因子的计算方法。由表I可见，在一定浓度范围内，各对照品的浓度与其峰面积具有一定的线性关系。不同杂质对照品的截距有一定差异，将各标准曲线的截距校正为0，得标准曲线的斜率，氟尿陡的斜率与各杂质斜率的比即为校正因子(f)。通过计算，IA,IB,IC,ID,IE相对于氟尿嚓陡的校正因子分别为:1.1,0.9,0.8,1.5,1.3.
　　4.7校正因子耐用性的考察采用3台不同的液相色谱仪，根不同的色谱柱，分3d在相同的条件下，分别取杂质系列标准曲线溶液及氟尿系列标准曲线溶液，进行分析，记录氟尿嚓陡和各有关物质的相对保留时间，并测定氟尿pig和各有关物质的标准曲线。根据校正后的标准曲线的斜率计算各有关物质的校正因子，结果见表2。由于校正因子的误差包括有日间误差、仪器误差及色谱柱误差等综合因素，各校正因子的误差范围在仪器分析误差允许范围内。
　　4.8样品测定　精密量取样品溶液20L，按“2”项下色谱条件，进样，记录色谱图(见图4)。按照中国药典2010年版的计算方法和限量要求，采用不加校正因子的主成分自身对照法，“单个杂质不得过0.5%，杂质总量不得过0.75%”。按照此计算方法和限度判断，97批氟尿嚓陡注射液和2批氟尿},A原料全部符合要求。
　　但是，如果按照BP2010原料项下的计算方法和限度要求:"IA,IB,IC的计算采用标准曲线法，ID,IE的计算采用加校正因子的主成分自身对照法，校正因子分别为1.5和1.3;单个杂质不得过0.1%，杂质总量不得过0.5%，小于0.05%的杂质可忽略不计”。仅有2批制剂中的杂质D未超过0.1%,14批制剂和2批原料的杂质总量未超过0.5%。
　　本研究制备了杂质对照品IA,IB,IC,ID,IE的标准曲线，供试品中所有已知杂质的计算均采用标准曲线法，未知杂质的计算采用不加校正因子的主成分自身对照法，通过对97批制剂及2批原料的有关物质进行计算，结果见图5。由图5可以看出，采用标准曲线法计算，IA,IB,IC和IE的含量均在0.0S%以下，ID的平均含量在0.09%一0.85%之间;采用不加校正因子的主成分自身对照法计算，未知杂质的含量在0.1%左右;杂质总量约为0.10%-0.93%之间。
　　为了保证检验结果的准确性，从而保证药检执法的公信、公正，同时兼顾方法的准确、快捷，建议借鉴BP2010氟尿嚓陡原料项下的计算方法，即采用加校正因子的主成分自身对照法。通过计算，IA,IB,IC,ID,IE相对于氟尿嚓陡的响应因子分别为:1.1,0.9,0.8,1.5和1.3。由图5可以看出，IA,IB,IC和IE的含量均在0.OS%以下，采用标准曲线法或不加校正因子的主成分自身对照法计算对最终的结果影响不大，为简便考虑，建议保留自身对照稀释法计算含量。将ID标准曲线法的测定结果与加校正因子的主成分自身对照法(BP2010)、不加校正因子的主成分自身对照法(ChP2010)的测定结果互相比较(见图6)，结果发现标准曲线法的测定结果与BP2010的加校正因子的主成分自身对照法的测定结果更接近。因此建议，氟尿嚓陡原料及注射液中有关物质检查方法修改为:杂质D(相对保留时间为1.54)采用加校正因子的主成分自身对照法计算，校正因子为1.5，其他杂质采用不加校正因子的主成分自身对照法计算，采用此计算方法得到的判定结果与标准曲线法的结果基本一致。
　　5结论
　　由以上分析结果可以看出，本方法灵敏度高，重复性好，IA,IB,IC,ID,IE的平均回收率均在95%以上，且主峰与杂质峰能完全分离，因此，本方法可用于氟尿嚓陡原料及注射液中有关物质的定性及定量分析。在计算过程中，为了保证检验结果的准确性，同时兼顾检验方法的简便、快捷，建议杂质D(相对保留时间为1.54)采用加校正因子的主成分自身对照法计算，校正因子为1.5，其他杂质采用不加校正因子的主成分自身对照法计算，以更准确的反映氟尿嚓陡原料及注射液中有关物质的含量。
　　参考文献
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