高糖培养对神经膜细胞株EGR2蛋白表达的影响及其意义

　　糖尿病神经病变是糖尿病最常见的并发症之一，占糖尿病并发症的60%~70%[1].神经膜细胞（SCs）是周围神经系统中的神经胶质细胞，起源于胚胎的神经嵴细胞，神经嵴细胞发育为神经膜细胞前体，然后继续发育为未成熟的神经膜细胞，最后形成成熟的神经膜细胞，成熟的神经膜细胞包绕周围神经的轴突形成有髓或无髓神经纤维。神经膜细胞的外表面有基膜，能分泌神经营养因子，促进受损神经元轴突的再生。体内高血糖状态会引起神经元损伤，神经元损伤后，神经膜细胞会去分化，退回到干细胞样状态以促使神经元修复。已有许多研究将神经膜细胞作为体外研究模型，探索糖尿病神经病变发病机制，然而国内外并未见高糖状态下早期生长反应蛋白2（EGR2）表达情况的研究。EGR2属于锌指家系的转录因子，可激活神经膜细胞内大量与成髓相关的基因和合成脂质所需要的酶来调控神经膜细胞成髓，是神经膜细胞形成髓鞘的关键因子。EGR2的病理生理功能未能完全了解，本文研究高糖状态下EGR2的表达情况，以进一步研究EGR2在体内高血糖状态下的表达及其在神经病变中的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1材料神经膜细胞株（RSC96细胞株，中科院上海细胞库），DMEM/F12培养基（Gibco公司），胎牛血清（Gibco公司），青链霉素双抗（Gibco公司），6孔培养板（Nest公司），超净工作台（Airtech公司），EGR2抗体（Abcam公司）。

　　1.2细胞培养及鉴定RSC96细胞株培养到适当密度后传代，用S.100鉴定细胞株，并分别用5.5mmol/L（N25mmol/L（H组）葡萄糖浓度的培养基培养3d.

　　1.3免疫细胞化学用0.25%胰蛋白酶将神经膜细胞制成悬液，血球计数板计数后以5×104/mL接种到预先包被有多聚赖氨酸的玻片上，于5%CO2、37℃条件下培养24h.取出盖玻片，0.01mol/LPBS（pH=7.4）漂洗3次，每次10min,4%多聚甲醛固定10min;PBS漂洗3次，每次10min,用3%H2O2封闭内源性过氧化物（30min）；PBS漂洗3次，每次10min,用5%羊血清37℃条件下封闭30min.加入2%羊血清稀释的兔抗鼠一抗，4℃过夜，0.01mol/LPBST漂洗5次，每次5min,通用PV9000.1在37℃下孵育30min;0.01mol/LPBST漂洗5次，每次5min,用DAB显色，显微镜下观察颜色深浅，合适的时候用单蒸水终止显色。显微镜下观察并拍照。

　　1.4蛋白质印迹细胞生长到一定密度后，每瓶细胞加400μL细胞裂解液，裂解30min后，收集裂解液保存备用。制作电泳所需的分离胶和浓缩胶，根据蛋白浓度测定结果，在每孔加60μg蛋白，电泳，封闭，孵育一抗，二抗，显色，照相。应用ImageJ软件测量EGR2相对于β。tublin的灰度值。

　　1.5统计学处理应用SPSS17.0进行统计学分析，组间比较采用秩和检验，以犘<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1免疫细胞化学染色结果阴性对照组不染色，H组和N组细胞形态均一，细胞生长状态良好，细胞染色均一，EGR2蛋白在细胞质表达，两组显色时间相同的情况下，H组显色相较N组稍深。见图1.组），.2蛋白质印迹结果β。tublin条带清晰，显色状况良好，H组的EGR2表达量大于N组，统计灰度值后二者比较，差异有统计学意义（犘<0.05）。

　　3 讨论

　　神经膜细胞及其分泌的各种因子是构成神经再生微环境的主要成分，不仅在支持保护轴突，维持周围神经的正常功能与良好微环境等方面起到重要作用，而且在糖尿病神经病变病理变化的形成和代偿等方面起也起到重要作用[2].动物实验和临床研究都观察到糖尿病周围神经组织损伤后神经膜细胞可出现增殖反应[3.4],以促进轴突的修复和再生。Myers[5]于1998年已发现慢性糖尿病会导致少突胶质细胞包裹的中枢神经髓鞘异常。Wang等[6]在研究高糖培养的星形胶质细胞时发现，高糖能上调白细胞介素6（IL.6）、肿瘤坏死因子α（TNF.α），白细胞介素1β（IL.1β），白细胞介素4（IL.4）等炎症因子，高糖培养能够导致星形胶质细胞产生活性氧簇（reactiveoxygenspecies,ROS）的水平增加，同时激活NF.κB和STAT3.ROS清除剂，NF.κB和STAT3特异性抑制剂能够阻断这些炎症因子的上调。星形胶质细胞和少突胶质细胞是中枢神经系统中的两种神经胶质细胞，其生物学性状与神经膜细胞多有相似。EGR2不仅在周围神经系统形成髓鞘时起关键作用，也可能在糖尿病导致的神经病变中起作用。Zaman等[7]研究发现EGR2参与了多个信号通路，并在多个生物活动中发挥功能，且在体内培养诱导胫骨形成中发现EGR2表达增加；在体外实验中，损伤培养的胫骨源性骨形成细胞系UMR106细胞中EGR2mRNA的表达也会升高。Jessen等[8]对孕14d大鼠的胚胎背根神经节中的神经膜细胞进行培养，发现IL.6使EGR2mRNA和蛋白表达量显着增加。Zhang等[9]用IL.6受体和IL.6配体形成复合物，刺激gp130的生成，导致神经膜细胞成熟细胞增多，并导致神经膜细胞表达EGR2增多。gp130的条件减少能导致周围神经脱髓鞘和退化[10].IL.6能够在神经膜细胞中激活STAT3,这已经得到证实[11].Zuliani等[12]也研究证实在高糖环境中，IL.6、IL.6受体和gp130均会升高。本研究中免疫组化和蛋白质印迹均显示，神经膜细胞在高糖环境中培养3d后，EGR2蛋白表达增加，差异有统计学意义（犘<0.05），提示在高糖对神经膜细胞的刺激作用下，EGR2蛋白表达水平升高。EGR2在高糖培养的神经膜细胞中表达升高，可能是高糖导致IL.6表达升高，从而导致gp130升高，激活STAT3途径，进而导致神经膜细胞成熟增加，并最终导致神经膜细胞表达EGR2增多。

　　参考文献

　　[1]ArgoffCE,ColeBE,FishbainDA,etal.Diabeticperipheralneuro.pathicpain:clinicalandquality.of.lifeissues[J].MayoClinProc,2006,81（4Suppl）：S3.11.

　　[2]BungeRP.TheroleoftheSchwanncellintrophicsupportandre.generation[J].JNeurol,1994,242（1Suppl1）：S19.21.

　　[3]KalichmanMW,PowellHC,MizisinAP.Reactive,degenerative,andproliferativeSchwanncellresponsesinexperimentalgalactoseandhumandiabeticneuropathy[J].ActaNeuropathol,1998,95（1）：47.56.

　　[4]屈岭，梁晓春，张宏。高糖对体外培养神经膜细胞影响的研究进展[J].基础医学与临床，2008,28（12）：1324.1328.

　　[5]MyersSF.Myelin.sheathabnormalitiesinthevestibularnervesofchronicallydiabeticrats[J].OtolaryngolHeadNeckSurg,1998,119（5）：432.438.

　　[6]WangJ,LiG,WangZ,etal.Highglucose.inducedexpressionofinflammatorycytokinesandreactiveoxygenspeciesinculturedas.trocytes[J].Neuroscience,2012,202:58.68.

　　[7]  ZamanG,SuntersA,GaleaGL,etal.Loading.relatedregulationoftranscriptionfactorEGR2/Krox.20inbonecellsisERK1/2protein.mediatedandprostaglandin,Wntsignalingpathway.,andinsulin.likegrowthfactor.Iaxis.dependent[J].JBiolChem,2012,287（6）：3946.3462.

　　[8]JessenKR,MirskyR.OriginandearlydevelopmentofSchwanncells[J].MicroscResTech,1998,41（5）：393.402.

　　[9]ZhangPL,LevyAM,Ben.SimchonL,etal.Inductionofneuronalandmyelin.relatedgeneexpressionbyIL.6.receptor/IL.6:astudyonembryonicdorsalrootgangliacellsandisolatedSchwanncells[J].ExpNeurol,2007,20（2）：285.296.

　　[10]PizziM,SarnicoI,BoroniF,etal.Preventionofneuronandoligo.dendrocytedegenerationbyinterleukin.6（IL.6）andIL.6recep.tor/IL.6fusionproteininorganotypichippocampalslices[J].MolCellNeurosci,2004,25（2）：301.311.

　　[11]WangL,LeeHK,SeoIA,etal.Celltype.specificSTAT3activa.tionbygp130.relatedcytokinesintheperipheralnerves[J].Neu.roreport,2009,20（7）：663.668.

　　[12]ZulianiG,GalvaniM,MaggioM,etal.Plasmasolublegp130levelsareincreasedinoldersubjectswithmetabolicsyndrome.Theroleofinsu.linresistance[J].Atherosclerosis,2010,213（1）：319.324.

　　（收稿日期：2014.01.08）