中药熏蒸对佐剂型关节炎大鼠血液、关节中白细胞介素-1β的影响

作者                                   作者单位

陆继娣             中国人民解放军广州军区广州总医院,广东 广州 510030

中药熏蒸疗法操作方便,适用症广,疗效确切,但在熏蒸机理的研究方面刚刚起步。本实验从熏蒸对佐剂型关节炎(AA)大鼠血液、关节中白细胞介素-1β(IL-1β)的影响,探讨该疗法的抗炎作用机理,为该疗法推广应用提供临床和实验依据。

1 实验材料

.1 动物 健康清洁级雄性Wistar大鼠50只,体重(140±20)g,中国人民解放军广州军区广州总医院实验动物中心提供。

1.2 试剂

弗氏完全佐剂,美国Sigma公司;IL-1β的酶联免疫(ELISA)检测试剂盒,上海森雄科技实业有限公司,美国RD公司;IL-1β的免疫组化检测试剂盒,武汉博士德公司。

1.3 熏蒸药物

羌活20 g,独活20 g,防风15 g,桂枝15 g,细辛10 g,川芎20 g,海风藤30 g,徐长卿30 g,姜黄20 g,苏木20 g,冰片1 g,中国人民解放军广州军区广州总医院中药房提供。熏蒸方中前10味中药由自动煎药机煎煮成53.3%浓度的中药液保存,熏蒸治疗时按高、低浓度分别稀释成6.67%和3.33%浓度的中药液,冰片待熏蒸治疗前加入药液中。

1.4 仪器

动物熏蒸笼;三用电子恒温水槽,广东省汕头市医用设备厂产品;低温离心机,美国Beckman公司产品;LEICA-RM2245型组织切片机;Lt2-12550酶标仪,澳大利亚Biocell公司产品;NIKON-E600显微镜;生化培养箱。

2 实验方法

2.1 佐剂性关节炎模型的建立

50只大鼠随机留取10只作为正常组,其余40只接受弗氏完全佐剂(CFA)造模,即将CFA充分振荡混匀后,在每只造模组大鼠右踝关节下0.5 cm处皮下注射CFA 0.1 mL[1]。注射后1 d,各造模组大鼠注射区局部色红、肿胀、皮温升高,活动欠灵活,第3日右足肿胀达峰值,并于3～5 d开始逐渐消退,至第10日,大鼠右足再度肿胀,并同时出现对侧后肢肿胀,呈进行性加重。多发性关节炎的出现表明大鼠AA模型建立成功。

2.2 分组及处理方法

造模后第11日,40只模型大鼠随机分成4组,模型组、水熏组、中药低熏组、中药高熏组各10只。正常组和模型组常规喂养,不做熏蒸处理;水熏组给予(59±1)℃蒸馏水熏蒸,蒸气温度为39～40 ℃;中药低熏组给予相同温度3.33%的中药液熏蒸;中药高熏组给予相同温度6.67%的中药液熏蒸。将大鼠放入动物熏蒸笼,开启电子恒温水槽,待蒸汽温度达到熏蒸要求时,开始熏蒸并计时,每次熏蒸20 min,连续10 d。造模后第21日,予腹腔麻醉后心腔取血,置抗凝管内混匀,后颈椎脱臼法处死。大鼠处死后,取右后肢踝关节及以下足爪,扒去皮毛,剔除肌肉、肌腱等附着组织,剪去足爪,留取完整踝关节,用10%中性甲醛固定48 h,EDTA脱钙15 d,脱水、浸蜡、包埋、切片。

2.3 指标检测

2.3.1 大鼠血液中IL-1β含量的检测

大鼠抗凝血行ELISA法检测血液中IL-1β的含量,测定步骤按检测药盒说明书严格执行。

2.3.2 大鼠关节中IL-1β含量的检测

大鼠关节切片后脱蜡、水化;PBS洗2次,各5 min;用PBS配置新鲜的3% H2O2,室温封闭8 min,蒸馏水洗3次;抗原修复(pH 6.0的枸橼酸钠缓冲溶液在恒温水浴加热至95 ℃,放入载玻片加热15～20 min);自然冷却后PBS洗5 min;滴加正常山羊血清封闭液,室温20 min。甩去多余液体;滴加Ⅰ抗,4 ℃保湿过夜;37 ℃复温45 min;PBS洗3次。滴加生物素化Ⅱ抗,室温20 min;PBS洗3次;滴加新配试剂SABC,室温20 min;PBS洗4次;DAB显色3 min(镜下掌握显色程度);蒸馏水洗;脱水、透明、封片、镜检。每组切片随机抽取10张,并在显微镜下选取大鼠踝关节周围视野,摄像取图像保存,以关节周围软骨及软骨下骨组织细胞胞浆染成黄褐色为阳性,根据细胞染色深浅不同,统一定义命名阴性、弱阳性、强阳性细胞,采用HMIAS-2000高清晰度彩色医学图文分析系统免疫组化测量程序(武汉千屏影像技术有限公司开发)分析图像,获取各类细胞数占视野内总细胞数的比值(系统数据以小数表示),分别为阴性细胞百分比、弱阳性细胞百分比(简称“弱阳比”)、强阳性细胞百分比(简称“强阳比”)、阳性细胞百分比为弱阳比与强阳比之和(简称“阳性比”),记录弱阳比、强阳比、阳性比数据。

2.4 统计学方法

大鼠血液中细胞因子含量检测选正常组、模型组、水熏组、中药高熏组、中药低熏组进行对比分析,实验所有数值均为计量资料;免疫组化检测选各组的阳性细胞含量比进行对比分析,实验所有数值均为计数资料。采用SPSS10.0统计软件,运用方差分析进行多组间两两比较。统计结果以x±s表示,P<0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果

(见表1、表2)表1 中药熏蒸对AA大鼠血液中IL-1β含量的影响(略)注：与正常组比较,*P<0.01;与模型组比较,#P<0.05;与水熏组比较, △P<0.05(下同)表2 中药熏蒸对AA大鼠关节中IL-1β含量的影响(略)

4 讨论

根据人体中药熏蒸的原理,我们以三用电子恒温水槽作为熏蒸药箱以保证熏蒸温度恒定,另做一底面大小相当的鼠笼(47 cm×27 cm×7 cm),底面覆以透气性能良好的细格钢丝网,四面用不锈钢做成,顶盖用大格钢丝网做成,熏蒸时把大鼠放入小格中,关紧上盖,待药液达到合适温度时,置于恒温水槽上即可开始熏蒸。该实验方法具有易操作、易控温、蒸汽量大及可重复性能好的优点。本实验结果显示,各造模组的IL-1β含量均有显著升高,与正常组比较差异显著。经熏蒸治疗后,各治疗组(包括水熏组、中药低熏组、中药高熏组)IL-1β的含量较模型组均有显著降低;治疗组间比较,中药高熏组在指标的改善上优于水熏组;中药低熏组与水熏组比较,前者略优于后者,但统计学上未见明显差异。原因可能为：一是治疗时间不够长;二是动物实验不同于临床,动物熏蒸的药物最低有效浓度需进一步探索。以上实验结果提示,中药熏蒸疗法治疗关节炎的抗炎机理可能与下调血液中异常升高的致炎因子IL-1β水平有关。

采用免疫组化观察AA大鼠病变踝关节局部细胞因子的表达,结果显示各造模组的IL-1β阳性表达明显强于正常组;各治疗组与模型组对比,中药高熏组、中药低熏组IL-1β强阳比都明显低于模型组;治疗组间比较,中药高熏组、中药低熏组对IL-1β强阳性细胞比值的改善均优于水熏组。以上实验结果提示,中药熏蒸对AA大鼠关节局部炎性细胞因子表达有明显的抑制作用,可能与熏蒸药物中的中药成分激活部分抗炎途径、下调致炎因子在局部表达的水平有关。本研究结果提示,增加中药熏蒸的浓度可能提高熏蒸治疗的抗炎效果。

在对水熏组单独分析时发现,蒸汽的温热作用也具有重要的治疗作用,可降低血液中炎性细胞因子IL-1β的含量。因此,蒸汽的温热作用也是

【参考文献】

[1] 李仪奎,王钦茂.中药药理实验方法学[M].上海：上海科学技术出版社, 1991.305.