还原SDS-PAGE电泳不适于鉴定尿激酶原单链比例

作者：杨波,李天德,王广义,陈练

作者单位：解放军总医院心内科,北京市 100853；西藏军区总医院心内科，西藏 拉萨市 850007
    
    【摘要】  　　目的：探讨还原SDS-PAGE电泳检测尿激酶原单链比例的价值。方法：用PCR扩增的方法构建抗凝血酶的尿激原突变体。Arg精氨酸156-Lys赖氨酸156点突变可删除凝血酶作用位点。将突变体基因转染入dhfr-CHO细胞（dihydrofolate reductase deficient -Chinese hamster ovary cells 二氢叶酸还原酶缺陷型—中国仓鼠卵巢细胞）。收取无血清培养上清液，用离子交换层析和凝胶过滤层析纯化抗凝血酶的尿激酶原（TRpro-UK)。结果：用还原SDS-PAGE电泳测得的尿激酶原单链比例是86.72%，而显色底物法为96.91%。而且随着电泳上样量的增加，单链比例明显下降。结论：还原SDS-PAGE电泳是在强还原条件下进行的，可能不宜用于鉴定尿激酶原单链比例。

    【关键词】  尿纤溶酶原激活物　电泳　点突变

　　Reducing SDS-PAGE is not suitable for the detection of pro|urokinase single|chain form ratio/YANG Bo,LI Tian|de,WANG Guang|yi,CHEN Lian//

　　Abstract：Objective:To investigate the value of reducing SDS-PAGE to detect single|chain ratio of pro|urokinase(pro-UK).Methods:A thrombin resistant pro-UK mutant(Arg156-Lys 156) was constructed with PCR amplification. The thrombin cleavage site was deleted by this mutagenesis.The mutant gene was transfected into dhfr-CHO cells( dihydrofolate reductase deficient Chinese hamster ovary cells).Serum|free supernatant liquid was harvested and TRpro-UK(thrombin resistant pro-UK) purified with ion|exchange chromatography and gel filtration chromatography.Results:The single|chain ratio was 86.72% with reducing SDS-PAGE and 96.91% with chromogenic substrate assay. The single|chain ratio changed greatly with the variant sample concentrations.Conclusion:Reducing SDS-PAGE,which is under violate reducing condition, is not suitable for detecting pro-UK single|chain ratio.

　　Author′s　address：Department of Cardiology, PLA General Hospital, Beijing, 100853,China

　　Key words：Urine plasminogen activator;Electrophoresis;Point mutation  

　　以前我们发现CHO细胞表达的天然尿激酶原（单链尿激酶型纤溶酶原激活剂）单链比例的测定用显色底物法（S-2444）与还原SDS-PAGE法结果不同。用同一样品，S-2444测定比例为99%，而还原SDS-PAGE测定为90%[1]。我们曾经认为是存在thromb-UK的缘故。凝血酶（thrombin)水解pro-UK产生一种双链的形式，与tcu-PA（双链尿激酶型纤溶酶原激活剂）在还原电泳的条件下无法区分。Thromb-UK具有双链的形式及单链酶原的性质[2]。到目前为止，对此现象尚无令人信服的解释。为探讨此问题，本实验构建了一种抗凝血酶的pro-UK突变体（thrombin resistant pro-UK,TRpro-UK，抗凝血酶的尿激酶原)。

　　1  材料与方法

　　1.1  一般资料限制性内切酶，DNA修饰酶，T4DNA连接酶，DH5α感受态细胞，DNA分子量标准，低分子量蛋白标准购自New England Bioabs 公司（美国）。尿激酶（UK）标准购自WHO国际生物标准实验室（WHO International Laboratory for Biological Standards, 英国）。尿激酶的生色底物S-2444和凝血酶购自Sigma 公司（美国）。抑肽酶（aprotinin)购自Bayer公司（德国）。DNA纯化试剂盒，质粒提取试剂盒购自Promage公司。DNA测序Bioasia公司完成。CHO-K1（dhfr-CHO)细胞系，pIRES 表达载体，天然尿激酶原基因由本实验室保存。

　　1.2  方法pro-UK突变体构建：以下的引物用于PCR扩增。引物1引入Nhe Ⅰ酶切位点，并在起始密码子前引入信号肽。引物2构建Arg156-Lys156突变。引物3在终止密码子后引入Xho Ⅰ酶切位点，（1）5′-TCGTGAGCGACTCCAAAGGCAGCAATGAACTTCATCAAGTTCC-3′；（２）5′-CTCTGAGGCCCAAGTTTAAGATTATTG-3′；（3）5′-CTAAAGCTTCTCGAGTCAGAGGGCCAGGCCATTCTCTTC-3′。TRpro-UK的表达：扩增后的pro-UK突变体用Nhe Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切，回收纯化后与pIRES表达载体连接，转化入DH5 α感受态细胞。提质粒后用琼脂糖电泳鉴定。阳性质粒测序正确后转染入dhfr-CHO细胞。TRpro-UK的纯化：收集无血清培养上清，用SP-Sepharose Fast Flow 色谱柱纯化，平衡缓冲液为10 mM磷酸缓冲液和0.1M氯化钠，pH5.8。在280 nm紫外监测下用10 mM磷酸缓冲液和0.5 M氯化钠洗脱。洗脱产物再用Sephacryl S-200HR凝胶过滤色谱纯化。单链比例分析：SDS-PAGE使用5%积层胶和12%分离胶，考马斯亮蓝G250染色。发色底物法测定单链比例参照文献[1]。

　　2  结果

　　2.1  SDS-PAGE法图1所示为TRpro-UK的SDS-PAGE电泳鉴定，薄层扫描结果显示单链比例为86.72%。

　　图 1  SDS-PAGE电泳分析TRpro-UK的产品（略）

　　1为样品在非还原条件下的电泳带，3为还原条件下的电泳带，2为蛋白分子量标准（由上到下分子量为97400，66200，43000，31000，201000，14400 Daltons)。

　　2.2  显色底物法制作尿激酶（UK）标准曲线。

　　表1  405 nm处不同UK浓度的OD值（略）

　　图2  不同UK浓度的回归曲线（略）

　　表2  405 nm处不同UK浓度的回归方程及相关系数（略）

　　从图3得到UK标准曲线方程y=49.601x-3.6174，相关系数为0.9997。

　　图3  UK标准曲线（略）

　　TRpro-UK蛋白质产品单链比例。

　　图4  蛋白质产品的OD值对时间作图（略）

　　由图4得出显色速率为0.2319，带入UK标准曲线方程（y=49.601x-3.6174)。计算得到样品活性为7.885 1，乘以稀释倍数50倍，得到双链活性为394.255。与上同理，当TRpro-UK被thermolysin（嗜热杆菌金属蛋白酶）充分激活后，得到显色速率0.587，乘以500稀释倍数，得到总活性为12 749.193 5。双链尿激酶原比例为双链活性除以总活性，得到3.092 4%。因此单链比例为96.91%。不同上样量样品的还原SDS-PAGE电泳。如图5及表3所示，随着上样量从1 μg增加到15 μg，单链比例从97.78%降到79.52%。

3  讨论

　　自1958年首次静脉应用链激酶治病急性心肌梗塞（AMI）以来，溶栓剂已经挽救了大量生命。尿激酶原，也称为单链尿激酶型纤溶酶原激活剂（single|chain urokinase|type plasminogen activator,scu-PA)，是尿激酶的前体酶原形式，具有纤维蛋白特异性。大规模临床试验证实，尿激酶原是一种安全有效的溶栓剂，目前已经广泛用于临床治疗。在尿激酶原生产过程中，需要鉴定每批产品的质量，即总活性和单链比例，单链比例越高，表明尿激酶原含量越高，即产品纯度越高。以往应用2种方法鉴定单链比例，即还原SDS-PAGE电泳法和显色底物法（S-2444）。但2种方法测定的结果始终不一致。本实验通过基因工程技术，采用基因点突变的方法，旨在解除上述矛盾，为尿激酶原生产及临床用药提供实验及理论依据。

　　图5  不同上样量的还原SDS-PAGE电泳（略）

　　表3  不同上样量时，薄层扫描得到的单链比例（略）

　　尿激酶原由411氨基酸组成，在Lys158-Ile159有纤溶酶水解位点。另一个重要的水解位点是Arg156-Phe157的凝血酶作用位点，水解产生一种活性很低的双链产物。纤溶酶Lys158-Ile159水解产物（plasmin-UK)具有溶栓活性。凝血酶与纤溶酶作用位点只差2个氨基酸。凝血酶水解pro-UK产生的双链thromb-UK，用还原电泳法无法与双链尿激酶型纤溶酶原激活剂，即尿激酶［UK（tcu-PA）］区分。但thromb-UK活性很低，并且对抗纤溶酶的激活，而使尿激酶原失去溶栓活性。Thromb-UK具有双链的形式，也就是说它的分子量近似有活性的plasmin-UK，用SDS-PAGE电泳的方法与后者无法区分：同时Thromb-UK又具有单链酶原的性质，也就是说它从蛋白性质上讲是一种酶原，而不酶，因此用生色底物法无法区分［3］。人工合成的发色底物S-244（pGlu-Gly-Arg-pNA)可以被tcu-PA水解。Scu-PA(单链尿激酶型纤溶酶元激活剂，即尿激酶原）是u-PA（尿激酶型纤溶酶原激活剂）未被激活的酶原形式，不能水解S-244，据此可以测定u-PA中的单链比例；即在凝血酶充分激活条件下，根据S-2444显色速率计算得到尿激酶原总活性；在不添加凝血酶的条件下，蛋白产品仅有双链的尿激酶可以使S-2444显色，据此计算得到产品中双链成分的比例，其余即为单链尿激酶原所占的比例。而thromb-UK具有酶原的性质，酶原是不能使S-2444显色的。S-2444在tcu-PA作用下水解产生对硝基苯胺pNA，产生淡黄色。原理如下：scu-PA纤溶酶or凝血酶tcu-PApGlu-Gly-Arg-pNA tcu-PApGlu-Gly-Arg-OH+pNA以前我们发现天然pro-UK单链比例用S-2444方法测定为99%，而用还原SDS-PAGE法测定仅为90%左右［1］。其他研究者也发现了类似现象［4，5］。对此现象的一种解释为：样品中含有scu-PA,tcu-PA和thromb-UK。因为thromb-UK与tcu-PA分子量相似，用电泳无法区分二者分子量的差别，而同时具有酶原的性质，用S-2444方法无法与真正有活性的尿激酶原区分。这种猜想尚未经实验证实。我们用点突变的方法构建了Arg156-Lys156突变体（抗凝血酶的尿激酶原，TRpro-UK)，去掉了凝血酶作用位点，因此在我们的蛋白质品中不存在thromb-UK。但实验仍发现S-2444测定单链比例为96.91%，还原SDS-PAGE为86.72%。上述关于thromb-UK的假设无法解释此结果。本实验还发现不同上样量的还原SDS-PAGE得到的单链比例显著不同，上样量越大，单链比例越低。这提示还原SDS-PAGE不能准确地定量描述尿激酶原单链比例。还原SDS-PAGE是在强还原及加热条件下进行的，如此强烈的反应条件可能导致尿激酶原被分解成较小的片段。本研究以实验为基础，对以往应用于鉴定尿激酶原的常用方法（蛋白质电泳）提出质疑，其确切机制研究尚有待于进一步探讨、验证。

    【参考文献】
  　[1]胡显文，高丽华，李世崇，等.发色底物法定量测定重组u-PA产品的总活性和单链比例［J］.军事医学科学院院刊，2003，27（5）：349-353.

　　[2]Gurewich V. Pro|urokinase:history mechanisms of action, and clinical development.In:Loscalzo J, Saashara AA.New therapeutic agents in thrombosis and thrombolysis［J］.New York:Marcel Dekker，1997，495-511.

　　[3]Ichinose A, Fujikawa K, Suyama T. The activation of pro-urokinase by plasma kallikrein and its inactivation by thrombin［J］. J Biol Chem，1986，261:3486-3489.

　　[4]Corti A, Nolli ML, Soffientini A, et al. Purification and characterization of single|chain urokinase|type plasminogen activator from human A431 cells［J］.Thromb Haemost，1986，56(2):219-224.

　　[5]Burke SE,Lubbers NL,Nelson RA, et al. Recombinant pro|urkinase requires heparin for optimal clot lysis and restoration of blood flow in a canine femoral artery thrombosis model［J］. Thromb Haemost，1993，69(4):375-380.