高脂血症对大鼠主动脉壁连接蛋白mRNA表达的影响

作者：尹力,黄体钢,李广平,杨万

作者单位：天津医科大学第二医院心脏科, 天津300211
    
    【摘要】  目的 通过观察高脂血症对大鼠血管壁连接蛋白（connexin，Cx ）37、40、43及45 mRNA表达的影响，探讨AS的发病机制。方法 雄性Wistar大鼠 72只，按体重随机分为3组。分别给予基础饲料（C组）、嘧啶胆酸钠饲料（P组）及高脂饲料（HF组）喂养。于实验开始前1 d给予P组及HF组大鼠Vit D360万U/kg 1次性腹腔内注射，此后每30 d追加Vit D3 30万U/kg。C组大鼠给予等体积生理盐水腹腔内注射。各组大鼠于实验8周及22周分两批处死。心脏穿刺取血测定血清胆固醇（CH）及甘油三酯(TG)。然后取胸主动脉行病理检查；取腹主动脉匀浆后提取总RNA，利用RTPCR分析腹主动脉Cx mRNA的表达水平。结果 在实验8周及22周时HF组大鼠血清CH [（1050±521）mmol/L及（1098±187）mmol/L]和TG[(725±198) mmol/L及（752±169）mmol/L]水平明显高于其余两组。HF组大鼠在实验8周时主动脉内膜面可见较多散在斑点状红色脂质浸润区，内皮细胞及平滑肌细胞增生。实验22周时可见粥样斑块形成及管壁钙化。实验8周时半定量Cx 43 mRNA水平（091±030）明显高于其余两组，实验22周时各组间Cx 43 mRNA水平无统计学差异。其余三种连接蛋白（Cx 37、 Cx 40、 Cx 45）mRNA水平在实验8周和22周时各组间均未见统计学差异。结论 血管壁表达的四种主要Cx中，Cx 43受高脂血症影响表达量增加；Cx 37、Cx 40及Cx 45 mRNA表达量则不受上述因素的影响。

   【关键词】  粥样硬化； 高脂血症； 连接蛋白

　　动脉粥样硬化（atherosclerosis, AS）的发病机制中细胞因子、化学激动剂和生长因子等所起的关键作用已有定论[1,2]。此外，还发现AS及癌症的发病率均随年龄增长而增加。在癌症的发生机制中，细胞经过缝隙连接进行的直接交流起到重要作用[3]。由此设想AS和缝隙连接之间可能存在相互关系。1993年，Polacek等用原位杂交的方法显示，人颈AS病变处巨噬细胞来源的泡沫细胞含有丰富的连接蛋白（connixen， Cx）43（Cx43）mRNA，而来源于正常人外周血的单核细胞并不表达Cx43 mRNA[4]。该发现使上述设想得以证实。此后，多项实验从不同层面、不同角度对此关系进行研究。主要涉及Cx43在血管壁不同部位及粥样硬化病变不同结构中的分布及其量的改变。因模型种属及时间的差别，结果各异。而高脂血症及AS时血管壁各种Cx mRNA表达情况的报道尚少见。本实验欲观察高脂血症是否影响血管壁Cx mRNA的表达，以期对AS的发病机理作进一步的探讨。

　　1  材料和方法
　　
　　11  动物模型建立 雄性Wistar大鼠72只，6周龄，平均体重（14400±1020）g。由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供 [许可证号：SCXK(军)2002001；质量合格证号：0004894]。基础饲料适应性饲养2周后体重达（22680±1686）g。按体重随机分为正常对照组（C组）；嘧啶维生素D3对照组（P组）和高脂组（HF组），每组各24只。C组大鼠饲以基础饲料，其成分为：玉米32％、花生饼15％、豆粕10％、麦粉20％、麦麸10％、鱼粉5％、稻糠5％、盐及多种维生素3％（由天津利居生物用品供应中心提供）；P组大鼠饲以嘧啶胆酸钠饲料，成分为：牛胆酸钠05%（北京市海淀区微生物培养基制品厂）、丙基硫氧嘧啶02%（深圳中联制药厂）、基础饲料993%；HF组大鼠饲以高脂饲料，成分为[5]：胆固醇3%（天津市英博生化试剂有限公司）、牛胆酸钠05%、丙基硫氧嘧啶02%、白糖5%、猪油10%、基础饲料813%。于实验开始前1 d，给予P组及HF组大鼠一次性腹腔内注射Vit D3 60万U/kg（上海通用药业股份有限公司）。此后每30 d追加30万U/kg。C组给予等体积生理盐水腹腔内注射。于实验开始后8周及22周每组各取10只大鼠，腹腔内注射戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉，穿刺心脏取血5 mL，4000 r/min离心10 min，分离并分装血清，于－70℃冰箱保存备用。处死大鼠，仔细分离截取全长主动脉。将与心脏连接的升主动脉、主动脉弓及降主动脉近段放入15%的中性甲醛溶液中固定，制备石蜡切片，供HE及免疫组化染色。将降主动脉远段及腹主动脉段分装入不同组织冻存管中，立即放入－190℃液氮罐冷冻24 h，然后转入－70℃冰箱保存待用。降主动脉远段用于冰冻切片，苏丹Ⅳ染色；腹主动脉段用于提取RNA及RTPCR。与此同时，每组各取2只大鼠处死，分离主动脉，将完整主动脉沿腹侧正中线剪开，平铺于滤纸上，外膜面紧贴滤纸，内膜面朝上。立即放入15%中性福尔马林溶液中固定，苏丹Ⅳ染色，用于观察内膜面脂质浸润情况。

　　12  生化实验血清胆固醇（CH）及甘油三脂（TG）测定采用酶法，试剂盒购自中生北控生物科技股份有限公司。由Microlab 300型半自动生化分析仪（荷兰Vital公司）检测。

　　13  免疫组化染色兔抗鼠Ⅷ因子相关抗体（1∶100，用于确定血管内皮细胞）、小鼠抗大鼠βActin抗体 (1∶100，用于确定血管壁平滑肌细胞) 以及兔二步法和小鼠二步法免疫组化试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。按试剂盒说明操作。

　　14  RTPCR使用TRIzol（Invitrogen），采取一步法提取腹主动脉中总RNA，取1 μg总RNA 进行逆转录反应。以反应产物cDNA为模板进行PCR扩增。PCR引物序列分别是：内参三磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）sense：5′TAA AGG GCA TCC TGG GCT ACA CT，Antisense：5′TTA CTC CTT GGA GGC CAT GTA GG（XM_2212542,199bps）； Cx37：sense：5′GGC TGG ACC ATG GAG CCG GT，Antisense：5′TTC TGG CCA CCC TGG GGG GC（NM_0216541,421bps）；Cx40： Sense：5′CTG GCC AAG TCA CGG CAG GG，Antisense：5′TTG TCA CTG TGG TAG CCC TGA GG （BC0709351,307 bps）；Cx43： Sense：5′CGG CGG CTT CAC TTT CATTA，Antisense：5’AGA ACA CAT GGG CCA AGT AC（X066561,333 bps）；Cx45： sense:：5’TTG GGA CCA TTC GAG ACT CAC ，Antisense：5′TTG CTA GAT CCA AGC GTT CCT（NM_012567,209 bps）。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果经Gene Genius凝胶成像系统成像，GeneTools软件分析。得出各基因的IOD值。求出目标基因IOD/内参基因IOD的比值（Cx37/GAPDH，Cx40/GOPDH，Cx43/GOPDH，Cx45/GOPDH），进行半定量分析。

15  统计学处理 计量资料以±s表示，多组间均数比较采用单因素方差分析（OneWay ANOVA）。两两组间比较采用Student Newman Keuls法（方差齐）和GamesHowell法（方差不齐）。全部资料处理均使用SPSS 110统计软件包。P＜005为具有统计学意义。

　　2  结果

　　21  血清生化检测结果实验8周及22周时HF组大鼠血清CH及TG水平均明显高于C组及P组（P＜005）。P组与C组相比无统计学差异（表1）。

　　表1  各组大鼠实验8周及22周时的血脂水平（略）

　　注：与其余两组相比 *P＜005。

　　22  病理改变  为了解大鼠主动脉内膜面脂质浸润情况，我们从每组选取2只大鼠，截取全长主动脉，用苏丹Ⅳ染色。结果显示HF组及P组大鼠在实验8周及22周时主动脉内膜面柔软、光滑，偶见红色的脂质点。HF组大鼠在实验8周时主动脉内膜面可见较多散在斑点状红色脂质浸润区，以主动脉弓分支处及腹主动脉内膜面尤为集中突出；实验22周时血管壁变薄，内膜面可见黑色坏死斑点，脂质浸润斑点少见。C组及P组大鼠胸主动脉显微镜下结构正常，其管腔面由单层内皮细胞覆盖，显示为一条棕色细线；中膜由6~8层弹力纤维及散在于其间的平滑肌细胞构成(图1A、B)。HF组大鼠在实验8周时胸主动脉内皮细胞及平滑肌细胞增生（8/10例）。增生处内皮细胞数目增多，密度增加，呈单层或双层，最多时达三层，核增大，变圆，使正常棕色线状影像增宽成带状。增生的平滑肌细胞多达10余层，核增大，密度增加。免疫组化证实该处βActin信号增强，其间的弹力纤维成分减少 (图1C、D)。实验22周时可见粥样斑块形成(6/10例)，表现为内膜与中膜之间聚集有坏死物质碎片，其间有空泡区，苏丹Ⅳ染色显示空泡区有红色脂滴；局部内膜增厚，内皮细胞增生，内皮细胞下有散在增生的平滑肌细胞环绕坏死区 (图1E、F)。血管壁钙化（图1G）。

　　23  大鼠腹主动脉壁连接蛋白mRNA水平 实验8周时HF组大鼠腹主动脉Cx43 mRNA水平明显高于其余各组；实验22周时上述指标变化无统计学差异。Cx37、Cx40及Cx45mRNA水平在实验8周及22周时与C组相比差异均无统计学意义。

　　图1  大鼠主动脉壁显微镜下改变（略）
   
　　A： 正常大鼠主动脉壁内皮细胞为一条棕色线状单细胞层（IH×200）；B： 正常大鼠主动脉壁中膜由6~8层弹力纤维及散在于其间的棕色平滑肌细胞构成（IH×200）；C： HF组大鼠实验8周时主动脉管腔面内皮细胞增生 （IH×100）；D： HF组大鼠实验8周时主动脉壁平滑肌细胞增 （IH×100）；E： HF组大鼠实验22周时主动脉壁粥样斑块形成（HE×100）；F： 粥样斑块空泡区有红色脂质聚集（苏丹Ⅳ染色×75）；G： HF组大鼠实验22周时主动脉壁钙化（HE×100）。
　　
　　3  讨论

　　该实验结果显示，高脂饲料喂养加腹腔内注射维生素D3诱发大鼠产生高CH及高TG血症。在实验8周时可见主动脉内膜面脂质浸润，内皮细胞和平滑肌细胞增生；同时主动脉提取物中Cx43 mRNA水平明显增高。在实验22周时主动脉壁内可见粥样斑块形成，以及钙化病变，血管壁变薄；Cx43 mRNA水平较前降低。Cx37、Cx40及Cx45 mRNA水平在实验各时段与C组相比差异无统计学意义。连接蛋白在AS病变中的作用正在引起人们的注意。目前在血管壁已确定的连接蛋白有Cx37、Cx40、Cx43及Cx45四种[6]。其中有关Cx43的资料较为丰富。本研究显示实验8周时主动脉提取物中Cx43 mRNA水平明显增高。此期主动脉壁中膜平滑肌细胞大量增生，其成分占绝对优势。因此认为Cx43 mRNA水平增高与增生的平滑肌细胞有关。在实验22周时血管壁形成粥样斑块并伴有钙化，平滑肌细胞数量明显减少，与此相应的是Cx43　mRNA水平较前降低。无独有偶，Blackburn等报道，在人类早期冠状AS病变新生内膜处平滑肌细胞Cx43表达量增加，在疾病的后期阶段表达量下降[7] 。这与Yeh等[8]大鼠颈动脉损伤模型及Kwak等[9]小鼠粥样硬化模型中Cx43的表达有相似之处。前者发现在球囊损伤大鼠颈动脉内膜后1~3 d，中膜Cx43的分布模式由正常位于中膜的外侧区移向其内侧区靠近内膜的部分，表达量也有明显增加；在损伤后9~14 d，内膜增厚，其中的平滑肌细胞大量表达Cx43，此时，中膜平滑肌细胞Cx43的表达量继续增加。后者观察到在粥样硬化病变早期新生内膜及斑块下的中膜平滑肌细胞中有丰富的Cx43表达。增生的平滑肌Cx43表达增多的意义尚不完全清楚。近期研究显示，在粥样硬化早期，平滑肌细胞由收缩表型转变为合成表型，并出现增生，迁移。此种具有合成表型的平滑肌细胞产生大量的细胞外基质。后者是AS病变的物质基础之一。平滑肌细胞由收缩表型向合成表型转化时伴有Cx43的mRNA即蛋白表达量的增加，缝隙连接的交换功能增加[10]。近期研究结果显示，Cx43表达降低能抑制LDL受体缺乏（LDLR/）小鼠AS斑块的形成[11]。这不仅进一步证实了Cx与AS的相关性，而且说明Cx43的变化是AS病变形成的上游原因，而非下游结果。为进一步促进大鼠血中CH增高，我们在高脂饲料中加入了丙基硫氧嘧啶和牛胆酸钠；并给予腹腔内注射维生素D3诱发内皮功能异常，以利于AS病变形成。为了解上述三种药物是否对连接蛋白基因表达产生影响，特设P组。该组大鼠主动脉壁组织中未见与HF组大鼠相应的Cx43 mRNA改变模式，说明HF组大鼠血管壁Cx43 mRNA的变化与丙基硫氧嘧啶、牛胆酸钠及VitD3等因素无关。高脂血症对Cx37、Cx40影响的报道较少。Yeh等研究显示[12]，高CH饲料喂养诱发C57BL/6小鼠内皮细胞Cx40、Cx37表达量下降。人类Cx37的基因多态性可作为粥样硬化斑块发生的基因标志 [13,14]。而本研究结果中，血管壁组织Cx37、Cx40 mRNA表达在HF组无明显改变，这可能是我们的结果主要反映血管壁平滑肌细胞的Cx mRNA水平，而内皮细胞所占比重极小，不能对结果造成影响。目前关于Cx45在高脂血症及粥样硬化病变中的变化情况尚未见报道。研究结果未发现高脂血症及粥样硬化时Cx45 mRNA水平有变化。该实验结果提示，Cx43基因及蛋白表达量增加与AS早期病理改变中的平滑肌细胞增生相伴随。但在AS中的作用还有待于进一步实验证实。

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