慢性乙型肝炎患者肝组织低氧诱导因子1α的表达变化

低氧诱导因子(hypoxia一inducible factor, HIF )- la是介导细胞缺氧反应的关键性转录调控因子，在调节机体或细胞对缺氧的反应中CHB患者起关健作用’-a。慢性乙型肝炎(CHB)患者肝组织存在微循环障碍已被证实，但HIF一la的表达CHB患者肝组织微循环障碍关系的相关研究报道较少，本研究对81 例CHB患者肝组织HiF一1。的表达及定位作了初步观察。现将结果报告如下。

1资料与方法

1. 1研究对象2009年7月一2010年10月解放军第123医院南京军区肝病中心收治的CHB患者8l 例。男54例，女27例;年龄18 } 62岁，平均年龄 34. 8岁;病程1一20年，平均11 .4年。诊断符合2000 年中华医学会修订的《病毒性肝炎防治方案》的标准”。另取5例正常人肝穿标本作对照。

1.2 CHB分度依据结合肝组织炎症、坏死和纤维化程度，根据光镜观察结果，将81例CHB患者分为轻度28例，中度22例，重度31例。分组标准参照李玉林主编的第6版《病理学》中的标准〔6。

1.3标本采集及预处理方法肝活检采用日本产16 号肝活检针，is负压针吸肝组织，长度)1.5 cm，肝穿组织分为两部分:一部分立即置于10%福尔马林固定 (不少于12 h)，石蜡包埋，连续4 p.,m切片，作HE和免疫组织化学染色，光镜观察。另一部分用2. 5%戊二醛固定，1%四氧化饿固定，0. 1 mol/L磷酸缓冲液清洗，梯度酒精脱水，Ep812树脂包埋，超薄切片机切片，醋酸铀、柠檬酸铅染色，作透射电子显微镜观察。

1.4试剂来源HIF一1a鼠抗人单克隆抗体购自美国Santa cruze生物技术公司(货号:sc一13515)，即用型免疫组织化学EliVisionT}} plus试剂盒购自福州迈新生物技术公司(产品编号:K1T一9901/9902/9903

1.5免疫组织化学染色方法按试剂盒说明书操作，并以PBS代替一抗作为阴性对照。结果判定方法:未着色为阴性(一)、黄色为阳性(+)、深棕黄色为强阳性(++)

1.6统计学处理采用SPSS11.5统计软件进行统计分析，采用完全随机设计多个样本比较的Kruskal - }C albs H检验及多个独立样本两两比较的Nemenyi法检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 HIF-la的表达特点免疫组织化学显示:正常组肝组织染色阴性(图la) } CHB患者肝组织中 HIF一1。主要定位于肝小叶中央静脉周围细胞内，即位于肝腺泡的2区和3区，表明肝组织缺氧以中央静脉周围最为明显。H1F一1。在肝组织中的表达以肝细胞最为常见，其次为肝窦内皮细胞和肝星状细胞，在肌成纤维细胞和枯否氏细胞中亦有表达。CHB轻度患者HIF一la主要定位于肝细胞的胞浆和胞核部位，呈灶性表达(图1b) ;CHB中度患者肝细胞变性坏死加重，肝组织缺氧明显，HIF一1。表达范围力[fl大， HIF一1。在肝窦及肝细胞膜上呈片状表达(图lc)， CHB重度患者肝组织多旱弥漫性表达，炎症坏死及肝窦毛细血管化部位肝窦内皮细胞示强阳性表达，血管阻塞性病变周围尤为明显(图1d)二以PBS代替一抗的阴性对照显色阴性，其中CHB中重度患者肝组织切片中可见较多的炎细胞浸润(图2a一C)

2. 2 HIF - 1。的表达与肝组织病变的关系研究资料显示，随着肝组织病变程度的加重，HIF一1。表达强度逐渐卜升，阳性表达范围也逐渐加大，四组肝组织HTF一1。表达率不同(Hc =35. 35 ,P <0.01)，但相邻两组之间比较差异无统计学意义(P >0.05).其余各组两两比较差异有统计一学意义(P<0.05)(表j)

2. 3肝窦及窦间隙病变超微结构改变CHB轻度患者主要表现为肝窦狭窄，示肝细胞水肿伴微绒毛肿胀、空泡形成或断裂、线粒体肿胀、晴畸形或消失、内质网畸形;有的肝窦内皮撕裂、窗孔减少或变小;窦内见有淋巴、单个核细胞进人;部分伴窦周隙充血、肝窦腔见大量红细胞聚集、肝窦内皮细胞间出现电子致密斑、细胞膜间出现连接状态(图3a,4a) } CHB中度患者主要表现为肝窦阻塞或扩张，肝窦阻塞的成分中，有淋巴、单个核细胞、红细胞、细胞碎片、凋亡小体、糖原颗粒等混杂其中，在狄氏腔中可见明显的胶原沉积;扩张的肝窦有些断面腔内空虚，有些断面腔内含有红细胞、吞噬细胞及淋巴细胞，肝细胞凋亡明显(图 3b,4b)二CHB重度患者多表现为肝窦扩张和肝窦毛细血管化，在平行扩张的开卜窦之间形成较宽的旁路通道，肝细胞萎缩，肝窦顶端倒塌，有的肝窦内皮细胞与肝细胞分离，窦内皮细胞窗孔减小或消失伴基底膜形成;窦周隙扩大，与肝窦分离，见有新生断续的内皮细胞屏障，提示肝窦已转化成毛细血管(图3c.,4c)

3讨论 HIF一I最早由Semeriza等7一8在缺氧诱导的细胞核抽提物中发现，能与人红细胞生成素的3'增强子序列结合，促进其转录，是一种异二聚体结合n}}的蛋白质因子HrF一I由HIF一1。及HIF一1p两个亚基组成HIF一1(3亚基在细胞浆中稳定表达，而HIF- 工。亚基在翻译后即被泛素一蛋白酶水解复合体降解〔因此，在}巨常氧饱和度厂的细胞中基本检测不到。亚基的表达，但在缺氧条件下，。亚基的降解被抑制，此时可采用免疫组织化学染色法等方法检测到 HIF一}叮以诱导糖酵解基因的表达，促进无氧代测9;通过诱导血管内皮细胞生长囚子的表达，促进血管生成〔’。」;它可以诱导一氧化氮合酶、血红素氧化酶的表达，发挥扩张血管的作用{工’;它还能激活红细胞生成素基因的表达，使红细胞生成增加，提高携氧能力，从而使缺氧的组织细胞保持氧稳态及耐受低氧状态iz有研究表明’3 , HIF一1。在低氧状态时，表现为时一I}}I及低氧程度依赖性升高。

本研究发现，HTF 一1。在肝组织中的表达主要定位于肝小叶中央静脉周国细胞内，肝窦壁及血管纤维化区表达增强二随着肝组织病变程度的加重，HIF一1。表达的范国及强度随之加大，与肝组织电镜观察结果相吻合，提示肝组织的缺氧程度与肝组织病变程度呈正相关，且与肝脏微循环障碍关系密切理论上，HTF-1。的高表达对利t体是有益的是机体的一种自我保护机制，又、{于改善机体的缺=L状态或适应低氧环境具有积极意义，但是HIF一1二[El }J过度表达又」机体却是有害的当CHB 发生时.缺氧信号传递到HIP一la，此时不仅表现为 HIF - 1 a的降邹受抑也表现为HIF - 1 a转录}:Z活活性的增强.HTF一二口丁不被泛素一蛋白酶体系统降解而积累并进人核内与HTF一1p合成HIF一1徽活 HIF一1是细胞缺氧适应调节的关键步骤HIF一1活化使其靶)C因血管内皮细饱生长因子(}FGFi,结缔组织生长因子(CTGF)、血小板源生长因子(1'DGF ) , 基质金属蛋白酶抑制物一1C丁MP一1卜纤二容奏原教活抑制物一1 ( P_}I一川等表达卜调’二HTF一la}应过诱导} EGF,PDGF等因子的表达.促进血管生成增加血供，虽可暂时缓解肝组织的缺氧程度但这种异常的血管增生长远来看却是有害H1当致炎因子长期存在时，这些新生的小血管将会由于反复损伤而发生纤维化，并包绕肝小叶形成纤维间隔影啊}f细胞的正常物质代刚u二同时HTF - 1 a通过上调上述靶基因的表达促使细胞外}C质大量分泌，并抑制其降解，其结果必将导致肝窦阻塞和肝脏微循环障碍.

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