乙型肝炎病毒前C/BCP区变异的研究现状

HBⅤ感染呈世界性流行,全球约有35亿慢性HBⅤ感染者,我国现有慢性HBⅤ感染者约叨00万人,慢性乙型肝炎(CHB)患者约为⒛00万[1],其中30%~b^0%为HBeAg阴性CHB,HBeAg阴性感染者更易进展为肝硬化(LC)和肝细胞癌(HCC)[2J⊙自19⒆年%rman∶3J首次发现HBⅤ前C区18%位点的变异可形成HBeAg阴性的CHB之后,Ohm。to等[4]研究发现BCP区变异也可形成HBeAg阴性CHB。国内外对前C/BCP区变异的分子结构、生物学改变及对疾病的影响等方面进行了一系列研究[56]。近年来随着HBeAg阴性CHB比例不断增加[7∶,HBⅤ前C/BCP区变异研究也出现了一系列新的进展。

1HBⅤ前C/BCP区基因结构与变异后生物学意义

HBⅤ属嗜肝DNA病毒,其基因组长约32kb,为部分双链环状DNA。HBⅤ基因组主要包括四个开放读码框(oRF)分别为S、C、P和Ⅹ,其中C-ORF分为前C区和C区,前C区转录的pC-mRNA编码HBeAg、C区转录的C-mRNA编码HBcAg,调控序列位于前C及BCP区,这些区域一旦发生变异,常有重要的生物学改变。HBⅤ复制过程中前基因组(pgRNA)利用本身缺乏校正功能的多聚酶反转录成负链DNA,囚而较其他DNA病毒易于变异。此外在宿主的免疫压力和抗病毒药物等作用下,其相关基因也可不断出现各种变异,以确保其生物学优势,其中前C及BCP区是最常见的变异位点.

1.1前C区基因结构及其变异后生物学意义前C区是包装信号ε的一部分,在其二级结构(发卡结构)中18%与1858位点的碱基相对,1858位v点的碱基与基因型有关,A基因型的1858位点碱基C与18%位点碱基G相对,因匹配而稳定9但B、D、E基因型及多数C基因型中的1858位点碱基是T,与18%位'点碱基G不匹配,不稳定的碱基配对容易发生18%位点碱基G→A的变异而使干袢结构更为稳定[9],有利于病毒复制,变异株最终可因选择优势而逐渐成为优势株[ml11。此外,ntG18%A常伴nt⑶⒆9A变异,这种可增强其转录体与核糖体的结合,可能是代偿lltα⒆6A变异的适应性变化,使双点变异株更具选择优势[:]。

前C区的1896A点变异使野生株18%位碱基G突变为变异株的碱基A,致使前C氨基酸序列的AA28由色氨酸(TGC)变异为终止密码(TAG),使前C蛋白的翻译终止,导致HBeAg不能合成,但HBoAg并非结构蛋白,不参与病毒复制,对HBⅤ复制无明显影响,最终形成HBeAg阴性CHB。

1.2 BCP区基因结构及其变异后生物学意义

BCP区是病毒转录、反转录和正链合成的起点,也是多种细胞因子结合位点,其包含DR1区、前C和C基因的2种mRNA起点,并对"RNA的转录起重要作用。

BCP区变异常是多位点变异的组合,以ntA1762T和ntG17“A双变异最为常见,nt1762和lotI764变异可伴随nd钙1≈nt1755中的点突变。BCP区内的htA1%2T和ntG1%4A变异引起编码蛋白质1~RO位亮氨酸(Leu)变为蛋氨酸(Met),131位从缬氨酸(Ⅴal)变为亮氨酸(Lcu),使位于BCP上的内核受体结合位点转为肝细胞核因子-1(HNF-1)的结合位点[12]。由于转录因子结合的改变,使得前C区mRNA的转录降低,最终导致HBeAg水平下降到原来的1/5~1刀[13ls∶,可形成HBeAg阴性CHBc但HBeAg阴性患者的HBV复制力增强,甚至可高于野生株[15I6],究其原因可能为:(1)变异导致HNF·1核因子结合位点的增加,田RNA转录及HBcAg合成增强,由于上调核心蛋白的表达和下调前C蛋白的表达,从而加强衣壳化,导致病毒复制增加;(2)AI%夕α%4A及其他BCP点突变,可能改变由1742-1847位点碱基形成的田RNA二级结构,使其形成的茎襻结构松散,在逆转录中容易打开c王耀[17]对1例A1胞VG17“A双联突变和5例G17CZA/C1%6TT17硼A三联突变样品进行启动子活性及仝基因组复制力的研究,也证实双联突:变型和三联突变型的启动子活性分别是野生型的190^倍和1们~1⒛倍,病毒复制力分别是野生型的1“倍和1~,^Zl~⒉85倍c’

BCP区还存在碱基的缺失、插人突变:碱基缺失可能减弱启动子或增强子的作用,影响前C或ⅡRNA合成,导致HBeAg分泌减少或消失,常表现出较低水平的病毒血症[1:];插人突变常表现出较高的复制能力,可能是由于插人导致产生了新的TATA结合蛋白的结合位点c而HBeAg前体信号肽裂解酶作用部位ntG18ωT的变异可能导致HB枞g分泌障碍:19Jc最近的许多研究发现,前C/BCP区变异与机体细胞因子的变化也有关c李小芬:⒛J对120例CHB患者进行前C/BCP区变异及其血清细胞因子的检测,发现前C/BCP区变异组血清干扰素(IFN)γ、白细胞介素(IL)-10水平均明显高于无变异组及正常对照组。此外,黄力毅等:21∶也检测了176例HBⅤ慢性感染者血清HBⅤBCP区突变及细胞因子水平,发现BCP变异组的血清I'-10、Ⅱ'-12、肿瘤坏死因子(TNF)α、IFNγ和HBⅤDNA的水平明显高于无BCP变异组。由此可见HBⅤ前C/BCP变异时Th1类细胞因子IFNγ(II.-12的水平增高,m类细胞因子IL-10血清的水平也增高,但%1/T咆细胞因子的平衡被打破,最终导致肝炎进展。出现这种现象的可能原因是前C/BCP区变异导致免疫失衡,至使细胞因子产生增多,抑或是因为细胞因子增多导致免疫功能增强,最终使病毒在增强的免疫压力下产生变异。总之,前C/BCP区变异与细胞因子的变化可能是一种互为因果的关系,这些推测仍需更加深人的研究证实.

2前C/BCP区变异的检测前C/BCP区变异的检出率与各地HBⅤ流行株的基因型有关。前C区ntG1⒆6A变异在A基因型出现极少,在B、D、E基囚型的出现率较高。在中国HBV主要是B和C基因型,前C区lltGl⒆6A变异在中国的CHB患者中检出率高达狎%~∞%,在欧美主要是A基因型,故仅占其慢性HBⅤ感染的I2%~歹%,地中海地区主要为D基因型,在其CHB患者中检出率高达约⒇%。BCP区脏A1%2T/ntG17“A双变异虽然在A-D基因型中都能发现,但在基因犁A和C中更为流行,在基因A型中较D型常见,在基因C型中较B型常见ˉ2224。各地变异检出率的差异除与基因型有关外,与检测手段及标本选择亦有关。丁静娟等·s对HBⅤ前C区及BCP变异检测方法作了比较研究,结果发现错配聚合酶链反应-限制性片段长度多态性检测法(血PCR-RFI.P)较直接测序法对变异的识别特异性强。

患者病情不同,其HBⅤ前冫BCP区变异的检出率也不同。刘悦晖:26J研究HBⅤ前C区和BCP区变异与疾病的关系,用直接测序法对不同病情组患者的血清前C及BCP变异进行分析,发现前C区变异在HBⅤ携带者(AsC)、CHB、LC、HCC各组中的检出率分别为1333%、艏88%、∞39%、51犯%,BCP区变异检出率在ASC、CHB、LC、HCC各组中的检出率分别为10OO%、37.∞%、”73%、盯88%。可见,不同病情程度的患者间其前C/BCP区变异的检出率不同c由于HBⅤ的准种特性,同一感染者可同时存在野生序列和不同比率的前冫BCP区变异序列,二者的比率随着时间而变化,所以同一患者在不同的时期其前C/BCP区变异的检测结果也可不同,陈金军11对32例CHB患者进行HBⅤBCP及前C变异的动态研究,发现研究起始时BCP变异株感染率为弱9%,结束时为够5%,前C区变异株的感染率分别为⒓5%和313%,两种变异株在炎症活动中均具有优势积累。少数G18%A阳性样本HBeAg仍为阳性,但与未突变样本相比,这些样本血清HBeAg呈弱阳性,推测这些样本中共存有(⒛%的未突变序列,只是用PCR产物测序法尚不能检出。

3前C/BCP区变异的临床意义.

HBcAg与HBtAg由同一纂冈编码,序列大部分相同,在B细胞和T细胞有共同表位。血清中分泌型的HBcAg可封闭T细胞抗原表位,阻断细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对表达HBeAg或HBcAg决定簇的受染肝细胞的攻击,诱导T细胞对HBⅤ感染的免疫耐受[2:J。在非活动性携带者,血清分泌型HBeAg是HBⅤ引起免疫无应答的重要原因。

然而,HBⅤ前C/BCP区的变异可导致HBcAg的合成减少或停止,血清HBc坨水平下降或消失,但HBⅤ的复制增强。由于失去了HBcAg的免疫调节,表达HBcAg的肝细胞受增强的CTL细胞的细胞毒作用,激发或加重机体免疫反应,从而导致肝细胞的损伤进一步加重,可导致不同的临床结局:既可能导致乙型肝炎慢性化[29J,又可能促使一些患者病情加重c林国贤和杨凡分别对狃8例和ω例CHB患者进行分析,均发现HB波g阴性CHB患者的平均年龄高于HBeAg阳性者130"J,提示前C/BCP区变异可能使乙型肝炎慢性化。既往的研究也发现前C/BCP区变异后可导致重型肝炎甚至肝衰竭,如李小芬「201对ω例HBeAg阴性CHB患者轻、中、重度不同病情分析,发现G18%A变异、A1胞VG1%4A变异及联合变异组病情的严重程度均高于无变异组,病情有加重趋势。此外,杨玲[32j寸HBⅤ变异与慢加急性肝衰竭(ACLF)发病关系进行研究,结果也发现ACLF组的前C和BCP区变异率明显高于CHB的对照组。

肝细胞损伤的进一步加重导致肝脏纤维化,最终发展为肝炎肝硬化和HCC。戴利成等[33]和Tahhash等[34]研究发现前C区和BCP区变异与肝纤维化程度有关。方钟燎[35∶对5例乙型肝炎相关性肝硬化患者血清进行HBⅤ前C和BCP区序列分析,结果发现有739%和217%的LC患者分别出现BCP双突变和前C区终止突变。由此可见,前C/BCP区突变在LC患者中很普遍,它们可能是促使LC发生的一个因素。Tong等[36J又寸101例HBsAg阳性HCC患者和臼例HBeAg阴性慢性携带者进行对照研究,结果发现与携带者相比,HCC患者有更高的前C区和BCP区变异率。此外,他们进行Lo签函c相关性回归分析发现,前C/BCP变异可明显增加CHB患者发展为HCC的危险性。Tanaka等[37∶也分别对118例HBⅤC1基因亚型携带者(44%HCC)和210例C2基因亚型携带者(46%HCC)进行HCC的相关性分析,结果表明A17ωVG1%4A联合变异为HCC发生的独立相关因素。BCP区还存在Tl“3与Ⅴ1753等位点变异,这些位点变异也与HCC发生相关。HBⅤ前冫BCP区变异可改变宿主的免疫应答,而使受染肝细胞在增强的CTL免疫压力下发生癌变,这可能与病毒复制力增强,HBⅤDNA整合到肝细胞D№、中增多有关。由于BCP与X基因的部分重叠9Al%夕α7“A变异导致Ⅹ基因第B0和B1的密码子改变:3:],这些都可能导致肝细胞发生癌变的机会增加。

由于HBeAg阴性CHB更易进展为LC和HCC,近年来的研究越来越多的关注前〃BCP变异所产生的HBcAg阴性CHB。李知玉等[39]对101例肝穿刺活组织检查术的CHB患者分析,发现HBeAg阴性组炎症分级和纤维化分级明显重于HBeAg阳性组。这说明在HBcAg阴性CHB患者中,仍存在明显的肝脏病理学改变,并可发展为肝纤维化,甚至LC。但也有不同的研究结果,林国贤等[301和杨凡等[31]分别对bˉ08例和19例行肝穿刺活组织检查的CHB患者进行回顾性分析发现,HBcAg卯l+与HBeAg阳性CHB患者肝脏病理炎症分级及纤维化分期基本相同,这也说明HBcAg阴性CHB与HBeAg阳性CHB相比,其炎症与纤维化并未减轻,此类患者应及时抗病毒治疗,以免贻误病情。

综上所述,HBⅤ前C/BCP区变异可产生HBcAg阴性CHB,并可致病情加重,出现重型肝炎甚至肝衰竭,可使肝细胞损伤进一步加重而导致肝脏纤维化,最终可发展为肝炎LC和HCC,因此临床上应重视前VBCP区变异对患者病情的影响,及时作出正确的诊断与治疗。

4前C/BCP区变异

对抗病毒治疗的影响

对于前C/BCP变异与IFN抗病毒治疗的关系存在不同的观点。早期的许多观点认为,IFN的治疗应答与BCP变异相关,变异可提高IFN治疗应答,BCP变异可以作为预测IFN治疗效果的因素之一但近期大量相关的临床研究指出前〃BCP区变异可降低IFN抗病毒治疗的疗效,如肖扬等[42∶对qZI例前C/BCP区变异的HBeAg阳性/阴性CHB患者和120例无变异的HBcAg阳性CHB患者进行IFN治疗的研究,结果发现HBcAg阳性患者在IFN治疗期间,变异组的HBeAg消失率高于野生株,但前C区变异患者HBⅤDNA“反跳率”高于BCP变异患者及野生株患者,远期效果较差;HBcAg阴性患者IFN治疗12、⒛个月时HBⅤDNA复发率依次为IFN对照组(BCP变异组(前C区变异组<前C区联合BCP变异组,这说明前C/BCP区变异的CHB患者IFN治疗容易发生HBcAg阴转,但疗效不稳定,更易发生病毒学反跳或复发。

前αBCP变异与核苷酸类药物抗病毒治疗的关系也有不同的观点。shn等:43=研究认为前C区18%位的突变与拉米夫定长期治疗后低病毒学突破有关。但最近也有相关研究发现,前C/BCP区变异可降低核苷酸类药物抗病毒治疗的疗效G苏明华等[艹:研究前C及BCP变异与拉米夫定治疗后HBⅤDNA反弹的关系,对”例拉米夫定治疗后HBⅤDNA反弹的患者和19例从未使用抗病毒治疗的患者对照研究,结果发现反弹组前C与BCP变异率均明显高于对照组,这说明HBⅤ前C/BCP区变异可能与拉米夫定治疗后病毒反弹有关。此外,梁延秀’研究了37例HBeAg阳性和41例HBeAg阴性CHB患者使用核苷类似物抗病毒达治疗终点停药后的复发情况,结果发现HBeAg阳性患者的复发率笱9%低于HBcAg阴性者512%,尽管差异无统计学意义,可能与观察的例数较少有关,这也从另一方面说明核苷类似物治疗前C及BCP变异CHB患者可能更易发生停药后的复发。

综上,HBⅤ前C/BCP区变异株患者可能在抗病毒治疗过程中更易出现HBcAg阴转,但疗效不稳定,易出现病毒学反弹或停药后复发。在《慢性乙型肝炎防治指南》中提出HkAg阳性与HBcAg阴性CHB患者达到治疗终点所需的疗程不同[1],但临床上常见低耳BeAg水平高病毒载量的CHB患者在抗病毒治疗时易发生HBeAg阴转,达治疗终点后停药却容易复发,考虑HBcAg的阴转可熊是因为病毒前〃BCP区变异而非免疫清除引起,故在抗疯毒Ⅱ治疗时应该根据血清HBeAg水平及HBⅤDNA水平*决定冶疗的方案与疗程。对于低HBeAg水平的患者是否应该当作HBeAg阴性患者来对待以延长疗程,以及血清耳艹全g水平的具体界限值则需要更多大样本的临床与实验室研究来分析。

5结论:对于 HBE Ag阴性CHB,免疫清除转阴免疫清除转阴与变异阴转是完全不同的两种现象:患者免疫活跃而致病毒被清除,血清病毒水平很低;而HBⅤ前C/BCP区的突变所致阴转,患者免疫功能未激活,HBⅤ的复制增强,HBVDNA处于高水平。所以分析HBeAg阴转主要是由于免疫清除还是病毒突变引起,以防止前〃BCP变异导致HBdg阴转,误认为病毒已被免疫清除或静息,而延误抗病毒治疗时机,这对于临床医师评估病情和制订实施抗病毒治疗方案以及对预后的预测有重要意义。

参考文献

[1]中华医学会肝病学分会，中华医学会感染病学分会。 慢性乙型肝炎防治指南[J].临床肝胆病杂志，2011,（01）：Ⅰ-ⅩⅥ。

[2]任红。 中国慢性乙型肝炎治疗策略-2004年全国乙型肝炎治疗策略专家峰会纪要[J].中华肝脏病杂志，2005,（05）：326-328.
[3]Carman WF,Jalyan MR,Hadziyannis S. Mutation preventing formation of hepatitis B e antigen in patients with chronic hepatitis B infection[J].Lancet,1989,（8663）：588-590.

[4] Okamoto H,Tsuda F,Akahane Y. Hepatitis B virus with mutations in the e antigen-negative phenotype in carriers with e antibody to e antigen[J].Virology,1994,（12）：8102-8110.

[5] Sato S,Suzuki S,Akahane Y. Hepatitis B virus strains with mutations in the core promoter in patients with fulminant hepatitis[J].Annals of Internal Medicine,1995,（04）：241-248.

[6]Ogata N,Miller RH,Ishak KG. The complete nucleotide sequence of a pre-core mutant of hepatitis B virus implicated in fulminant hepatitis and its biological characterization in chimpanzees[J].Virology,1993,（01）：263-276.

[7]Liaw YF,Leung N,Kao JH. Asian-Pacific consensus statement on the management of chronic hepatitis B:a 2008update[J].Hepatol Int,2008,（03）：263-283.

[8]骆抗先。 乙型肝炎基础和临床[M].北京：人民卫生出版社，2006.78-90.

[9] Tacke F,Gehrke C,Luedde T. Basal core promoter and precore mutations in the hepatitis B virus genome enhance replication efficacy of Lamivudine-resistant mutants[J].Virology,2004,（16）：8524-8535.
[10] 陈金军，侯金林，王战会。 乙型肝炎病毒C基因启动子及前C变异的动态研究[J].中华实验和临床病毒学杂志，1999,（01）：57-60.
[11] Li J Buckwold VE,Hon MW. Mechanism of suppression of hepatitis B virus precore RNA transcription by a frequent double mutation[J].Virology,1999,（02）：1239-1244.
[12] Scaglioni P,Melegari M,Wands JR. Biological properties of hepatilis B viral genomes with mutations in the precore promoter and precore open reading frame[J].Virology,1997,（02）：374-381.
[13] Moriyama K,Okamoto H,Tsuda F. Reduced precore transcription and enhanced core-pregenome transcription of hepatitis B virus DNA after replacement of the precoree promoter with sequence associated with e antigen-seronegative persistent infections[J].Virology,1996,（02）：269-280.

[14] Buckwold VE,Xu ZC,Chen M. Effects of a naturally occurring mutation in thehepatitis B virus basal core promoter on precore gene expression and viral replication[J].Virology,1996,（09）：5845-5851.
[15]Tang H,Banks KE,Anderson AL. Hepatitis B virus transcription and replication[J].Drug News and Perspectives,2001,（06）：325-334

[16]王耀。 乙型肝炎病毒基本核心启动子变异对启动子活性及病毒复制力影响的研究[D].呼和浩特：内蒙古农业大学，2010.
[17] Sheldon J,Rodes B,Zoulim F. Mutations affecting the replication capacity of the hepatitis B virus[J].Viral Hepatitis,2006,（07）：427-434.
[18] 郭亚兵，侯金林，骆抗先。 重症乙型肝炎e抗原阴性患者前C变异株及其体外翻译[J].中华肝脏病杂志，2001,（01）：42-44.
[19] 黄力毅。 乙型肝炎病毒C基因启动子变异与白细胞介素10与12、肿瘤坏死因子α、γ-干扰素及病毒含量的关系[J].中华医院感染学杂志，2007,（11）：1321-1324.

[20] Watanabe K,Takahashi T,Takahashi S. Comparative study of genotype B and C hepatitis B virus-induced chronic hepatitis in relation to the basic core promoter and precore mutations[J].Gastroenterologia Y Hepatologia,2005,（03）：441-449.

[21]Huy TT,Ushijima H,Quang VX. Characteristics of core promoter and precore stop codon mutants of hepatitis B virus in Vietnam[J].Journal of Medical Virology,2004,（02）：228-236.

[22] Tanaka Y,Hasegawa I,Kato T. A case-control study for differences among hepatitis B virus infections of genotypes A（subtypes Aa and Ae）and D[J].Hepatology,2004,（03）：747-755.

[23] 丁静娟，刘悦晖，王梅。 乙型肝炎病毒前C区及基本核心启动子变异检测方法的比较研究[J].中华检验医学杂志，2006,（05）：402-406.

[24] 刘悦晖，丁静娟，张权。 慢性乙型肝炎病毒感染者病毒前C区和基本核心启动子区变异检测及意义[J].中华消化杂志，2005,（09）：526-529.

[25]白丽，王琳，徐东平。 234例慢性乙型肝炎患者HBV前C/BCP区突变分析[J].实用肝脏病杂志，2009,（01）：14-16.

[26]骆抗先。 乙型肝炎基础和临床[M].北京：人民卫生出版社，2006.56-57.

[27]彭文伟。 病毒性肝炎研究[M].广州：广东科技出版社，1998.37.

[28] 林国贤，黄庆华，林玉英。 HBeAg阳性与HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者的临床和病理对照[J].中华实验和临床感染病杂志，2010,（01）：27-32.

[29] 杨凡，李汛，龚作炯。 HBeAg阴性与阳性慢性乙型肝炎患者临床和病毒学特点分析[J].中西医结合肝病杂志，2012,（01）：15-16.

[30] 杨玲。 乙型肝炎病毒变异与慢加急性肝衰竭发病关系的研究[D].广州：南方医科大学，2007.

[31] 戴利成，周建方，王贤军。 乙型肝炎病毒基因前C区基因突变与肝纤维化的关系[J].浙江医学，1999,（09）：5131.

[32] Takahashi K,Aoyama K,Ohno N. The precore/core promoter mutant （T1762 A1764） of hepatitis B virus:clinical significance and an easy method for detection[J].Journal of General Virology,1995,（12）：3159.

[33] 方钟燎，庄辉，杨进业。 乙肝肝硬化患者HBV前C区和基本核心基因启动子序列分析[J].临床肝胆病杂志，2003,（03）：183-184.

[34]Tong M J,Blatt LM,Kao JH. Basal core promoter T1762/A1764 and precore A1896 gene mutations in hepatitis B surface antigen-positive hepatocellular carcinoma:a comparison with chronic carriers[J].Liver International,2007,（10）：1356-1363.

[35] Mukaide M,Orito E. Specific mutations in enhancer Ⅱ/core promoter of hepatitis B virus subgenotypes C1/C2 increase the risk of hepatocellular carcinoma[J].Journal of Hepatology,2006,（05）：646-653.

[36] Kuang SY,Jackson PE,Wang JB. Specific mutations of hepatitis B virus in plasma predict liver cancer development[J].Proceedings of the National Academy of Sciences（USA），2004,（10）：3575-3580.

[37] 李知玉，周大桥，杨大国。 慢性HBV感染者血清HBeAg及HBV DNA与肝组织病理分级、分期的关系[J].中国医药导报，2010,（20）：15-16.

[38] Marrone A,Zampino R,Luongo G. Low HBeAg serum levels correlate with the presence of the double A1762T/G1764A core promoter mutation and a positive response to interferon in patients with chronic hepatitis B virus infection[J].Intervirology,2003,（04）：222-226.

[39] Zhang X,Han Y,Lu Z. Effect of multiple mutations in the core promoter and pre-core/core region of hepatitis B virus genome on the response to interferon in e antigen-positive chronic hepatitis B[J].Gastroenterologia Y Hepatologia,2001,（04）：393-398.

[40] 肖扬，周岳进，王开鉴。 乙型肝炎病毒前核心区及基本启动子变异对干扰素抗病毒治疗应答的影响[J].肝脏，2005,（01）：37-38.

[41] Shin JW,Chung YH,Choi MH. Precore stop codon mutation of hepatitis B virus is associated with low breakthrough rate following long-term lamivudine therapy[J].Gastroenterologia Y Hepatologia,2005,（06）：844-849.

[42] 苏明华，江建宁，周元平。 乙型肝炎病毒基因型、BCP及PC区变异与拉米夫定治疗后HBV DNA反弹的关系[J].世界华人消化杂志，2007,（33）：3507-3513.

[43] 梁延秀。 核苷（酸）类似物抗乙型肝炎病毒达治疗终点停药后复发相关因素的研究[D].南宁：广西医科大学，2011.
[44]李小芬。 乙型肝炎病毒前C区及BCP区变异与临床关系的研究[D].衡阳：南华大学，2010.

[45]variant[J].Journal of Clinical Microbiology,2001,（09）：3200-3203.