甲型肝炎的实验室诊断检测方法研究进展

　　甲型病毒性肝炎简称甲肝，是一种由甲型肝炎病毒(HAV)感染引起的以肝脏炎症病变为主的传染病，主要通过粪-口途径传播。其病程呈自限性，引起急性重型肝炎者极为少见，随着灭活疫苗在全世界的使用，甲型肝炎的流行已得到有效的控制[1-2]。

　　1　病原学甲肝是一种急性病毒感染性肝炎。1974年Feinstone等[3]通过免疫电镜技术在甲肝患者粪便中发现甲肝病毒(HAV)。甲肝病毒是直径为27～32nm的小RNA病毒，其结构含有VP1～VP4四种多肽，基因组为单股正链RNA，约7500个核苷酸。HAV对酸、热(60℃1h)，以及乙醚、氯仿等有机溶液作用稳定，但加热100℃5min可使其灭活。

　　2　甲肝的公共卫生管理HAV的传播途径为粪-口途径，主要在发展中国家流行。通过对公共卫生环境的管理和自我保健意识的改善提高，在过去的几十年中西方国家HAV的感染率得到有效的控制[4-5]。提高人群的免疫水平是预防甲肝的主要措施，随着甲肝灭活疫苗应用覆盖面不断扩大，甲肝地区流行强度逐年明显减弱，甲肝疫苗应用于控制甲肝流行在实践中得到许多专家的认可。

　　3　甲肝的免疫机制在甲肝急性期患者血清中可以查出抗-HAVIgM及IgG，患者患病后2周抗-HAVIgM阳性率为100%，持续2～3周，然后迅速下降。因此，检测抗-HAVIgM可作为急性期的诊断指标。抗-HAVIgG是甲肝的主要中和抗体，一般可从病人血清中查出，此种抗体存在于患者体内很长时间甚至终身[6]。

　　4　甲肝的实验室诊断方法

　　4.1　甲肝抗原的实验室检测方法

　　4.1.1　RT-PCR法　该方法灵敏度高，特异性强。但需专门的仪器设备，操作过程复杂，操作需经专业培训的人员，且由于RNA容易降解，所以RNA的提取过程要求较严格。目前对该技术的应用主要是利用RT-PCR技术检测甲肝减毒活疫苗的病毒滴度，其重复性好，省时快捷，较组织培养法节约了大量时间[7-8]。

　　4.1.2　RT-PCR-ELISA法　该方法为半定量的检测方法。方法先通过RT-PCR扩增甲肝病毒RNA，再用ELISA法检测扩增产物。该方法的引物和探针均为特异性，保证了此方法的特异性，而联合利用ELISA方法则提高了检测的灵敏度。结果判断客观，同时也避免了凝胶电泳和溴化乙啶等化学有毒物质的应用。有试验结果表明，用ELISA方法检测PCR产物与凝胶电泳法相比，灵敏度可提高10倍。该方法稳定性高，重复性好。其缺点在于试验必须建立在RT-PCR的基础上，所以检测成本高[9]。

　　4.1.3　间接ELISA法　其原理为在已包被抗人μ链的酶标板中，加入已知的HAV-IgM阳性血清后，若待检血清中含HAV-Ag，则被其吸附，HAV-Ag再与经酶标记的甲肝抗体结合，底物显色后，根据颜色判断待检血清中是否含有HAV-Ag。试验操作简单，可作为常规检测甲肝减毒活疫苗感染性滴度的方法[10]。

　　4.1.4　SPA协同凝集试验　利用金黄色葡萄球菌细胞壁中的A蛋白(SPA)能特异性的与单克隆甲肝IgG的Fc段结合(IgG3除外)，抗体的Fab2段暴露在葡萄球菌的表面，仍保持与相应抗原特异性结合的特性，使之成为抗体致敏的载体颗粒，当待检样本中含有HAV-Ag时，即出现反向间接凝集反应。该试验灵敏度和特异性较前几种方法低，结果判断人为影响因素大，但是试验操作简单省时，设备要求低，可作为设备受限时的初步检测方法[11]。

　　4.2　甲肝抗体的实验室检测方法　抗HAV-IgM在急性HAV感染时出现早，上升快，高峰滴度高，故检测抗HAV-IgM可作为诊断急性HAV感染指标[12-13]。

　　4.2.1　ELISA　利用固相载体(如聚苯乙烯)有吸附免疫活性蛋白的特性，将抗人IgM特异性μ链抗体包被在聚苯乙烯微量滴定板上，并保持其免疫活性，其对血清中IgM有特异性选择作用，加入HAV-Ag和辣根过氧化物酶标记的抗-HAV-IgG，顺序反应后，再加入酶底物显色，用分光光度计在492mm波长上测量。结果以样品OD值与Cutoff值比较来判断[14]。ELISA法简单方便经济实惠不需要特殊设备，操作方便快捷，在一般实验室即可开展，适于大批量人群抗原抗体筛查，但是ELISA法在测定中影响因素较多[15]。样本处理时稀释倍数较高会影响检测结果的准确性。在定量检测时，由于ELISA法本身的原因敏感度为57.57mIU/mL，因此对抗体浓度的血清不能检出[16]。

　　4.2.2　放射免疫法(RIA)　直接固相放射免疫测定法(SPRIA)检测甲肝病毒特异性lgM抗体时，在稀释的待检血清中，加入被抗人IgM-μ链包被的聚苯乙烯珠，孵育后，血清中甲肝IgM抗体与之特异性结合形成抗原抗体复合物，此时加入甲肝病毒抗原，就形成抗IgM抗体-甲肝IgM-甲肝抗原复合物。加入125I标记的甲肝抗体，就形成了一个抗IgM抗体-甲肝IgM-甲肝抗原-125I标记甲肝抗体的复合物。用γ射线闪烁计数器测量小珠每分钟的脉冲数，即可知血清中是否存在甲肝IgM抗体。该试验操作复杂，但准确性好，灵敏度高，可超微量测定血清中的甲肝病毒lgM抗体[17-18]。

　　4.2.3　化学发光法(CLIA)　利用了免疫反应和化学发光本身的信号特异性，无放射性危害，避免人为误差，被誉为目前免疫检测的金标准[19]。

　　4.2.3.1　化学发光微粒子免疫法(CMIA)　该方法是一项新的化学发光技术，具有特异性强灵敏度高结果稳定可靠的特点。其检测甲肝抗体的原理是以顺磁性微珠作为包被载体包被甲肝抗原(HAV-Ag)后，与标本中的HAV-IgM发生免疫反应与之结合为抗原抗体复合物，此时加入吖啶酯标记的抗HAV-IgM抗体后形成包被抗原-待测抗体-吖啶酯标记的抗HAV-IgM抗体复合物，在特定的磁场区发生沉积，经反复洗涤使游离抗体与抗原抗体复合物分离，加入预激发液与激发液后，测定其激发光强度即可定量判定标本中的HAV-IgM浓度。CMIA法自动仪器及配套试剂，使人为因素减至最低，该法测定敏感性高，吖啶酯直接标记抗体，结合稳定，不影响抗体的生物学活性和理化特性，所以提高了稳定性和结果的可重复性，使批内差异与批间差异都较小[20]。

　　4.2.3.2　微粒子酶免疫分析法(MEIA)　该方法以包被有抗-(人)IgM的微粒子与样本HAV-IgM结合。随后加入甲肝病毒抗原，使其与结合到该包被微粒子上的抗-HAV-IgM反应。接着加入大鼠单克隆的抗-HAV-碱性磷酸酶结合物，与抗-HAV-IgM和HAV抗原形成的免疫复合物形成结合物。最后加入底物4-甲基磷酸伞形酮。碱性磷酸酶标记的结合物将催化该底物的磷酸基团被移除，从而生成荧光产物4-甲基伞型酮。此时通过比较荧光产物比率与平均指数校准品比率，即可测定该样本中的HAV-IgM抗体。该法普遍用于定量检测人血清或血浆中的HAV-IgM抗体[21]。与CMIA相比，其样本检测及抗干扰能力具有等效性，加上其自动化操作，能满足临床实验室检测需要[22]。

　　4.2.4　　斑点金免疫结合试验(DIGFA)　该方法是20世纪80年代发展起来的一种简便快速的床旁免疫检测新技术，1996年，肖乐义等[23]建立了胶体金免疫渗滤试验用于快速检测抗甲肝IgM抗体的方法。DIGFA法的优点是操作快捷，结果直观可靠，利用细胞单克隆培养的HAV-Ag，抗原直接固相在硝酸微孔膜滤上，活性时间更长。胶体金试剂保质期长，保存时间至少为一年。操作步骤简单，不需要仪器，人员培训简单，技术操作容易掌握。DIGFA法对于急诊来说，是一种优化的方法，其优点就是速度快，取得血清的情况下，10min可判读结果，但只能做定性检测，阳性率低于ELISA法，且对于弱阳性的表现度较差，容易造成弱阳性标本的漏读和误读，有试验表明该方法检测甲肝抗体的灵敏度是92.8%，特异度是92.98%，性价比和准确度方面都逊于ELISA法[24]。

　　4.2.5　间接免疫荧光技术　该方法用于检测抗HAV-IgM。从甲肝患者的粪便中分离到的甲肝病毒(BJ-l)，此病毒能够感染A549细胞并产生细胞病变。以感染此病毒的A549细胞制成抗原加上病人待检血清，再加上羊抗人μ链荧光血清，即可用荧光显微镜检查[25]。这一检测方法的特异性及灵敏性均较高。但免疫荧光技术容易产生非特异性反应，因此，要求稳定的实验条件，熟练、有经验的操作人员来判读阴性和弱阳性结果。

　　5　小结与展望甲肝是与公共环境卫生有关的世界范围内的急性恶性传染病之一[26]。我国是甲肝的高流行国家。1988年1月，上海地区曾暴发大规模甲肝流行，感染者31万余例，死亡11人[27]。随着甲肝疫苗的推广，使甲肝的暴发流行得到有效的控制。因其临床表现与其他肝炎相似，因此甲肝的实验室诊断结果就显得尤为重要。近年来出现了关于用基因芯片诊断甲肝病毒的报道[28]。因基因芯片对病原体的检测有高特异性和高效率性，其应用前景越来越受到广泛的关注和重视。进一步对这一芯片探针进行操作程序的规范和大样本量的复合检测将使基因芯片在疾病筛查和病毒性传染病的预防和控制中发挥重要的作用。

　　参考文献

　　[1]MartinA，LemonSM.Hepatitisavirus：fromdiscoverytovac-cines[J].Hepatology，2006，43(2Suppl1)：S164-S172.

　　[2]FrancoE，MeleleoC，SerinoL，etal.Hepatitisa：epidemiologyandpreventionindevelopingcountries[J].WorldJHepatol，2012，4(3)：68-73.

　　[3]FeinstoneSM，KapikianAZ，GerinJL，etal.BuoyantdensityofthehepatitisAvirus-likeparticleinCesiumchloride[J].JVirol，1974，13(6)：1412-1414.

　　[4]WasleyA，SamandariT，BellBP.IncidenceofhepatitisAintheUnitedStatesintheeraofvaccination[J].JAMA，2005，294(2)：194-201.

　　[5]刘燕敏，陈园生，崔富强，等.中国2004～2009年甲型病毒性肝炎流行病学特征分析[J].中国疫苗和免疫，2010，16(5)：453-456.

　　[6]Roque-AfonsoAM，Grangeot-KerosL，RoquebertB，etal.Diag-nosticrelevanceofimmunoglobulinGavidityforhepatitisAvirus[J].JClinMicrobiol，2004，42(11)：5121-5124.

　　[7]李淑焱，刘大维，田旺，等.RT-PCR一步法检测甲型肝炎活病毒方法的建立[J].微生物学杂志，2005，25(4)：28-31.

　　[8]许春海，李兆申，代俊英，等.乙型肝炎病毒cccDNA巢式-实时荧光定量PCR法的建立及应用[J].临床肝胆病杂志，2011，27(3)：2683-2685.

　　[9]吴星，毛群颖，张华远.甲型肝炎病毒的RT-PCR-ELISA检测法[J].中国生物制品学杂志，2006，19(6)：639-640.

　　[10]龙润乡，熊秋霞，李华，等.甲肝IgM抗体诊断试剂盒在甲肝病毒抗原检测中的应用[J].标记免疫分析与临床，2004，11(3)：173-176.

　　[11]岳启安，赵淑梅，李在连，等.用单抗标记SPA对甲型肝炎的诊断价值[J].潍坊医学院学报，1993，15(4)：262-264.

　　[12]姜立民，周康凤，陈悦青，等.酶联免疫吸附试验和微粒子酶免疫分析法检测血清甲型肝炎总抗体的比较研究[J].中国计划免疫，2007，13(1)：63-65.

　　[13]ChakvetadzeC，MalletV，GaussecL，etal.AcutehepatitisAvirusinfectionwithoutIgMantibodiestohepatitisAvirus[J].AnnIn-ternMed，2011，154(7)：507-508.

　　[14]HyunJJ，SeoYS，AnH，etal.OptimaltimeforrepeatingtheIgManti-hepatitisAvirusantibodytestinacutehepatitisApatientswithanegativeinitialtest[J].KoreanJHepatol，2012，18(1)：56-62.

　　[15]王克波，杨俊，杨志俊.ELISA试验的质量控制[J].中国卫生检验杂志，2005，15(1)：111-112.

　　[16]王红旗，金晶，成军，等.美国AbbottAxsym免疫分析仪性能初步评价[J].现代检验医学杂志，2003，18(2)：20-21.

　　[17]王兰兰，吴健民，李双庆.临床免疫学与检验[M].北京：人民卫生出版社，2007：71.

　　[18]江砚芳，刘素芳，谢勇，等.人免疫球蛋白类制品甲肝抗体效价检测方法的探讨[J].中国输血杂志，2010，23(6)：451-452.

　　[19]刘冀珑，乔惠理，邓泽沛.化学发光免疫技术[J].化学通报，2000(7)：49-53.

　　[20]DeguchiM，YamashitaN，KagitaM，etal.Quantitationofhepati-tisBsurfaceantigenbyanautomatedchemiluminescentmicropar-ticleimmunoassay[J].JVirolMethods，2004，115(2)：217-222.

　　[21]马芳芳，陈云，谢则金，等.HAV-IgM3种方法检测结果比较[J].临床军医杂志，2011，39(4)：774-775.

　　[22]金燕萍，贾莉，部小霞，等.微粒子酶联免疫分析法与化学发光微粒子免疫法在检测甲肝病毒抗体IgM中的比较[J].现代检验医学杂志，2010，25(1)：56-57.

　　[23]肖乐义，阎小君，徐德忠，等.斑点金免疫渗滤试验快速检测抗甲型肝炎病毒IgM抗体[J].第四军医大学学报，1996，17(6)：46-48.

　　[24]刘瑛，高红丽，徐德忠，等.斑点金免疫渗滤试验检测血清中抗-HAV抗体[J].第四军医大学学报，2000，21(11)：S232-233.

　　[25]田庚善.甲型病毒性肝炎的诊断[J].临床肝胆病杂志，1985，1(1)：10-12.

　　[26]DontsenkoI，KerboN，PullmannJ，etal.PreliminaryreportonanongoingoutbreakofhepatitisAinEstonia，2011[J].EuroSur-veill，2011，16(42)：19996.

　　[27]张莹珍，谢忠杭，陈彩粼，等.福建省2004-2009年甲型病毒性肝炎流行病学特征分析[J].海峡预防医学杂志，2011，17(2)：48-49.

　　[28]陈建明，韩俊，董辰方，等.通用型病毒检测芯片在三种人类致病病毒属检测中的应用[J].中华实验和临床病毒学杂志，2006，20(4)：327-330.

　　(收稿日期：2014-01-08)