甲型H1N1流感患者外周血T淋巴细胞亚群检测分析

　　甲型H1N1流感是由新型甲型H1N1流感病毒株所引起的一种新型呼吸道传染病，疫情自2009年3月在墨西哥爆发，迅速在全球范围内蔓延。该病的传染性比普通季节性流感强，高危人群出现流感样症状后，较易发展为重症病例[1]，其中部分患者迅速发展至急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，病死率较高[2]。国外学者也认为甲型H1N1流感患者的主要死因是ARDS，需要应用中小剂量糖皮质激素进行治疗[3-4]。由于激素使用的时机和剂量直接影响着患者的预后，如使用不当会导致患者自身免疫力受损，进而削弱后续治疗的作用，加快病毒复制，导致不必要的死亡。因此及时、有效检测甲型H1N1流感患者外周血细胞免疫水平，对普通季节性流感和甲型H1N1流感患者的鉴别诊断和指导临床用药具有重要意义。

　　1　资料与方法

　　1.1　一般资料　(1)甲型H1N1流感患者(n=40)：2009年10～11月期间本院急诊科收治的经咽拭子PCR检测阳性的临床确诊病例;男性31名，女性9名;平均年龄41岁(18～62岁)。(2)普通季节性流感患者(n=63)：2010年11～2011年1月就诊于本院急诊的普通季节性流感患者;男性39名，女性24名;平均年龄56岁(18～86岁);部分患者仅表现为咳嗽、发热等一般流感症状，部分患者有肺炎表现。(3)健康对照组(n=20)：2010年11～12月来本院进行健康体检者，选取与上述两组患者年龄、性别相匹配者;男性11名，女性9名;平均年龄45岁(18～84岁)。

　　1.2　方法

　　1.2.1　标本制备　8h内采集的乙二胺四乙酸三钾抗凝的新鲜血液。采血后立即颠倒混匀数次，将血液与抗凝剂混匀，以防止凝固，并于室温保存。

　　1.2.2　主要试剂和仪器　三色标记的抗体试剂盒MultiT-EST[含单抗CD3FITC/CD8PE/CD4PerCP和FACS(10×)溶血素)]和绝对计数管购于美国BD公司。FACSCalibur流式细胞仪也购自美国BD公司，配有635nm和488nm激光管，并能检测前向及侧向角。应用CaliBRITETM磁珠及FAC-SCompTM软件校准仪器，MultiSETTM软件获取及自动分析检测结果。

　　1.2.3　抗体标记　取20μLMultiTEST试剂置于绝对计数管底，加入50μL充分混匀的抗凝全血，在避光、室温的环境下孵育15min后加入45μL1×FACS溶血素，再次孵育。标本于24h内上机分析。

　　1.3　统计学处理　采用SPSS17.0软件进行统计学分析，计量资料以x±s表示，三组间两两比较采用方差分析，以p< 0.05为差异有统计学意义。

　　2　结　　果甲型H1N1流感患者CD3+T细胞水平明显低于普通季节性流感患者(p=0.001)和健康对照组(p=0.001)，普通季节性流感患者CD3+T细胞水平也明显低于健康对照组(p=0.019)。甲型H1N1流感患者CD4+T细胞明显低于普通季节性流感患者(p=0.001)和健康对照组(p=0.001)，普通季节性流感患者CD4+T细胞明显低于健康对照组(p=0.008)。甲型H1N1流感患者CD8+T细胞显著低于普通季节性流感患者(p=0.020)和健康对照组(p=0.001)，普通季节性流感患者CD8+T细胞与健康对照组比较差异无统计学意义(p=0.052)。见表1。

　　3　讨　　论甲型H1N1流感与普通季节性流感在致病性上存在差异，它更易侵犯下呼吸道和肺泡，从而导致急性的肺损伤，造成严重的并发症，病情的轻重可能与免疫反应的强弱密切相关[5]。机体内的CD3+T细胞水平反映成熟的总淋巴细胞水平，其主要包括CD4+T细胞和CD8+T细胞。正常情况下淋巴细胞亚群之间相互协调、相互平衡，使机体处于免疫稳定状态，可抵抗外界病原体的入侵。因此，T淋巴细胞在机体免疫系统对抗病毒感染中起关键作用[6]。本研究发现甲型H1N1流感患者外周血T淋巴细胞各亚群均明显低于普通季节性流感患者和健康对照组，这可能是因为甲型H1N1流感病毒具有嗜淋巴细胞特异性，可以在淋巴细胞内繁殖复制，可能导致大量淋巴细胞的破坏，从而使患者外周血CD3+T、CD4+T和CD8+T细胞明显减少，细胞免疫功能下降[7-9]。综上所述，甲型H1N1流感患者的淋巴细胞及亚群均受到不同程度的损伤，造成免疫功能减低。外周血淋巴细胞及各亚群的检测对于判断甲型H1N1流感感染患者免疫功能的改变有重要意义，且有助于与普通季节性流感进行鉴别诊断并指导临床用药。

　　参考文献[1]Soto-AbrahamMV，Soriano-RosasJ，Diaz-QuinonezA，etal.Pathologicalchangesassociatedwiththe2009H1N1virus[J].NEnglJMed，2009，361(20)：2001-2003.

　　[2]ChenYS，LinDY，TsaiHT，etal.Predictorsandoutcomesofre-spiratoryfailureamonghospitalizedpneumoniapatientswith2009H1N1influenzainTaiwan[J].JInfect，2010，60(2)：168-174.

　　[3]DawoodFS，JainS，FinelliL，etal.Emergenceofanovelswine-or-igininfluenzaA(H1N1)virusinhumans[J].NewEnglJMed，2009，360(30)：2605-2615.

　　[4]Quispe-LaineAM，BraccoTD，BarberioPA，etal.H1N1influenzaAvirus-associatedacutelunginjury：responsetocombinationosel-tamivirandprolongedcorticosteroidtreatment.[J]IntensiveCareMed，2010，36(4)：33-41.

　　[5]MunsterVJ，DeWitE，vandenBrandJM，etal.Pathogenesisandtransmissionofswineorigin2009A(H1N1)influenzavirusinferrets[J].Science，2009，325(5939)：481-483.

　　[6]金伯泉.医学免疫学[M].北京：人民卫生出版社，2008：126-127.

　　[7]FonteneauJF，GillietM，LarssonM，etal.Activationofinfluenzavirus-specificCD4+andCD8+Tcells：anewroleforplasmacytoiddendriticcellsinadaptiveimmunity[J].Blood，2003，101(9)：3520-3526.

　　[8]张永臣，赵伟，王念跃.甲型H1N1流感患者治疗前后外周血淋巴细胞与T细胞亚群的变化[J].临床检验杂志，2010：22(5)：386-387.

　　[9]陈颖，王军.重症甲型H1N1流感患者外周血T淋巴细胞亚群变化的临床意义探讨[J].中国医科大学学报，2011：5(2)：140-143.

　　(收稿日期：2013-12-15)