糖尿病肾病患者晚期氧化蛋白产物与SOD、TNF

      摘要:  目的  研究糖尿病肾病患者血清蛋白氧化损伤指标晚期氧化蛋白产物（AOPP）的改变及其与超氧化物歧化酶（SOD）、肿瘤坏死因子α(TNFα)的关系，探讨蛋白氧化损伤与糖尿病肾病氧化应激状态和炎症因子的关系。  方法  糖尿病患者85例，根据尿微量白蛋白排泄率和肌酐水平分为无肾病(DM)组、早期肾病(DN3)组、临床肾病(DN4)组、终末期肾病(DN5)组。用WitkoSarsat介绍的方法改进后分别测定各组的血清AOPP，黄嘌呤氧化酶法测定SOD，ELISA方法测定血清TNFα。  结果  DN5组患者的血清AOPP(117.8±64.8)μmol/L和DN4组的血清AOPP(80.0±23.0)μmol/L显著高于DM组(58.2±17.7)μmol/L（P<0.01）；DN3组血清AOPP(72.7±17.2)μmol/L与DM组比较无统计学意义。血清AOPP与SOD显著负相关（r=-0.217，P<0.05），与TNFα无明显相关性(r=-0.064，P<0.01)。  结论  临床糖尿病肾病患者的血清蛋白氧化较无糖尿病肾病患者增强，并且与糖尿病肾病氧化应激状态有关，但与炎症因子TNFα无明显关系。

　　关键词:  糖尿病肾病； 晚期氧化蛋白产物； 超氧化物歧化酶； 肿瘤坏死因子α

　　研究发现氧化应激与糖尿病肾病的发生发展密切相关[1]。氧化应激所致蛋白氧化损伤可能在糖尿病血管并发症中有重要作用意义。Kalousova等发现，从2型糖尿病的启动到临床发病的多年时间中，当轻度高血糖导致氧化应激后，蛋白氧化损伤就已经发生[2]。在肾脏疾病患者，氧化应激可促进单核吞噬细胞活化，介导炎症因子释放，导致蛋白氧化损伤[3]。因此，可能糖尿病肾病患者的蛋白氧化损伤是逐渐加重的，且与炎症因子有关。笔者检测不同时期糖尿病肾病患者血清蛋白氧化损伤指标晚期氧化蛋白产物（AOPP）水平，并观察其与血清抗氧化系统的指标超氧化物歧化酶（SOD）、炎症因子肿瘤坏死因子α(TNFα)的相关性，探讨蛋白氧化损伤与糖尿病肾病氧化应激状态和炎症因子的关系。

　　1  对象与方法

　　1.1  对象  按照1999年WHO糖尿病诊断与分型标准，选择南方医院内分泌科2型糖尿病住院患者85例，男性38例，女性47例；其中尿微量白蛋白排泄率（UAER）＜30 mg/24 h为无肾病组（DM组），UAER持续30～300 mg/24 h为早期肾病组（DN3组），UAER＞300 mg/24 h为临床肾病组（DN4组），血清肌酐（Cr）＞445 μmol/L为终末期肾病组（DN5组）。排除急、慢性感染和急性心脏、肝脏、胃肠道及脑血管病变患者；排除原发性慢性肾小球肾炎和其他继发性蛋白尿疾病如高血压肾病、慢性肾盂肾炎、系统性红斑狼疮性肾病等。患者进入研究<1月未服用抗氧化剂如维生素E、维生素C。各组年龄、病程、体质量指数（BMI）比较见表1。

　　表1  4组患者的临床资料（略）

　　Tab 1  Clinical characteristics of the study population

　　除性别为例数外，其余数据为x±s.  DM:无肾病；DN3：早期肾病；DN4：临床肾病；DN5：终末期肾病；UAER：尿微量白蛋白排泄率（(正常值：<30 mg/24 h)；Cr：血清肌酐（正常值：66～133 μmol/L).

　　1.2  试剂与设备  冰醋酸,碘化钾溶液1.16 mmol/L，氯胺T，迭氮钠磷酸盐(NaN3)缓冲液(pH 7.0)，三氯醋酸(TCA)溶液0.61 mmol/L，试剂均购自原第一军医大学试剂中心。黄嘌呤，黄嘌呤氧化酶 0.25 mg/mL，[5,5’二硫代双(2硝基苯甲酸)]（DTNB）显色液 1.0 mmmol/L，GSH溶液 1.0，均购自美国Sigma公司。化学发光增强剂lucigenin 2 mmmol/L购自美国Molecular Probe公司；人血清新喋呤 ELISA试剂盒96T购自德国IBL公司。分光光度计(T680,上海分析仪器厂)。化学发光仪(Wallac 1210,芬兰LKB公司)。自动酶标分析仪（Multiskan Mk3,美国Thermo公司）。

　　1.3  方法  受试者清晨空腹采静脉血2 mL,室温静置1 h内离心10 min(2 000 r/min),取血清避光保存于-70 ℃冰箱待测,所有标本一次测定。

　　1.3.1  AOPP测定  按文献[3]的分光光度计法加以改进：血清与PBS按1∶5稀释，以氯胺T同法稀释作空白对照，加入1.16 mmol/L KI 10 μL及乙酸20 μL后立刻测340 nm处的吸收值。AOPP浓度以氯胺T含量表示。

　　1.3.2  SOD及TNFα测定  SOD采用黄嘌呤氧化酶法:用磷酸钾缓冲液配制含0.1 mg/mL黄嘌呤和2 μmol/L lucigenin化学发光液。将样品10 μL加入96孔板内，空白加入PBS 10 μL。每孔加入新鲜配制的化学发光液200 μL。在化学发光仪上测本底发光值(25 ℃)。每孔加入黄嘌呤氧化酶10 μL启动化学发光，连续测定发光值(6 min)。将最高发光值减本底，计算各样品抑制发光的百分率，活性单位定义为：抑制50%发光值为一个活性单位，计算每mL样品活性单位(u)。
   
　　TNFα的测定采用ELISA方法：加生物素标记的抗体50 μL于包被抗体的微孔板的微孔内。再加标准或样品200 μL，混匀，加盖，37 ℃下孵育120 min。孵育的混合液倒空，用吸瓶在每一孔内加满洗涤液，然后倒空，重复5次，最后一次洗涤后，把微孔板在吸水纸上甩干。每孔内加入酶结合物200 μL，轻敲微孔板，使内容物充分混合，加盖，37 ℃孵育120 min。第2次孵育结束前15 min内配制底物溶液。按照前述方法重复洗板。每孔内加底物200 μL，加盖，37 ℃孵育20 min。每孔内加终止液100 μL，轻敲微孔板使内容物充分混合。30 min内用酶标仪在450 nm处测出D值。

　　1.4  统计学处理  数据以x±s表示, 采用统计软件SPSS 11.0进行处理。4组间比较采用非参数检验，相关分析采用correlatebivariatepearson检验。P<0.05为有统计学意义。

　　2  结果

　　2.1  各组患者血清AOPP检测比较见表2。

　　表2  4组血清AOPP、SOD、TNFα水平比较（略）

　　Tab 2  AOPP,SOD,TNFα concentration of each group

　　DM:无肾病； DN3：早期肾病； DN4：临床肾病； DN5：终末期肾病； AOPP：晚期氧化蛋白产物； SOD： 超氧化物歧化酶； TNFα：肿瘤坏死因子α.  与DM组比较，☆:P<0.05，☆☆:P<0.01.

2.2  相关分析  血清AOPP与SOD显著负相关（r=-0.249,P<0.05），与TNFα无明显相关(r=-0.064，P>0.05)(图1,2)。

　　AOPP: 晚期氧化蛋白产物;SOD: 超氧化物歧化酶.

　　图1  血清AOPP与SOD相关性分析（略）

　　Fig 1  Correlation between serum AOPP and SOD

　　AOPP: 晚期氧化蛋白产物;TNFα: 肿瘤坏死因子α.

　　图2  血清AOPP与TNFα相关性分析（略）

　　Fig 2  Correlation between serum AOPP and TNFα

　　3  讨论
   
　　近年发现糖尿病状态下，自由基与蛋白的反应在体内可能相当剧烈，估计人血浆内与过氧化氢反应的抗氧化物有10%～50%是蛋白质[4]。Telci等发现，在1型糖尿病患者，当有微血管并发症发生时，血浆中蛋白的氧化修饰已达到相当严重的程度。另外，蛋白氧化产物羰基蛋白在晶状体与玻璃体都存在，特别是眼底产生病变时更为显著，并伴有眼球抗氧化物系统的削弱[5]。
   
　　临床研究中，AOPP是反映蛋白氧化程度的敏感可靠指标[6]。AOPP主要成分是血清白蛋白被自由基和反应性氧系（主要是中性粒细胞的髓过氧化酶产生的氯化氧化物）氧化后的产物[67]。已经证实，氧化修饰后的蛋白产物（如过氧化蛋白和蛋白还原基团）容易捕获自由基释放的化学能量，引发自由基链式反应。蛋白质的酪氨酸残基被氧化后容易形成双酪氨酸键，导致蛋白质易于断裂、聚合和交联。AOPP作为没有氧化性的物质，是链式反应的终末产物，正是用于反映双酪氨酸键产物的指标[8]。TNFα是一种多效因子，具有多种生物学效应。在许多疾病如慢性肾功不全、糖尿病患者参与慢性炎症状态的发生发展。有学者在研究慢性肾功能不全患者中发现AOPP与IL1β、TNFα有显著相关[3]，提示慢性肾功不全患者蛋白氧化损伤与炎症因子相关。
   
　　本实验中，DN5组和DN4组的AOPP水平高于DM组（P<0.01，P<0.05），提示在2型糖尿病的肾病发展过程中，蛋白氧化损伤不断加剧。SOD水平随着糖尿病肾病的进展而逐渐下降，提示糖尿病肾病患者氧化应激程度随着病情进展而加重，使抗氧化酶系统不断削弱，这与许多实验的结果一致[911]。AOPP浓度与SOD显著负相关，说明AOPP也反映了糖尿病患者的氧化应激程度，与糖尿病肾病患者的氧化应激程度紧密相关。
   
　　实验中发现AOPP浓度与炎症因子TNFα无明显关系，原因可能是2型糖尿病患者TNFα受到其他因素如晚期糖基化终末产物(AGE)的影响，或者参与蛋白氧化损伤另有其他重要的炎症因子。糖尿病患者蛋白氧化损伤与炎症因子关系尚未确定。
    　　
　　笔者认为，氧化应激引起的蛋白氧化损伤在糖尿病并发症发展过程中可能有重要意义。通过进一步研究和证明蛋白氧化损伤在糖尿病并发症中的作用有利于揭示糖尿病并发症的发病机制，蛋白氧化标志物的研究和监测还可为抗氧化物药物用于治疗和预防糖尿病并发症提供依据[12]。

　　参考文献：

　　[1]  Takebayashi K,Matsumoto S,Aso Y,et al. Aldosterone blockade  attenuates urinary monocyte chemoattractant protein1 and oxidative stress in patients with type 2 diabetes complicated by diabetic nephropathy[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2006,91(6):22142217.

　　[2]  Kalousova M,Skrha J,Zima T. Advanced glycation endproducts and advanced oxidation protein products in patients with diabetes mellitus[J]. Physiol Res, 2002,51(6):597604.

　　[3]  Santangelo F,WitkoSarsat V,Drueke T,et al. Restoring glutathione as a therapeutic strategy in chronic kidney disease[J]. Nephrol Dial Transplant, 2004,19(8):19511955.

　　[4]  Wolff S P,Dean R T. Fragmentation of proteins by free radicals and its effect on their susceptibility to enzymic hydrolysis[J]. Biochem J, 1986,234(2):399403.

　　[5]  Telci A,Cakatay U,Salman S,et al. Oxidative protein damage in early stage type 1 diabetic patients[J]. Diabetes Res Clin Pract, 2000,50(3):213223.

　　[6]  Wu Z X,Xue Y M,Li C Z,et al. Advanced oxidation protein products in diabetic nephropathy patients and its relation with superoxide dismutase, glutathione peroxidase, neopterin[J]. J Central South Univ(Med Sci), 2005,30(6):704707.

　　[7]  Naskalski J W,Marcinkiewicz J,Drozdz R.  Myeloperoxidasemediated protein oxidation: its possible biological functions[J]. Clin Chem Lab Med,  2002,40(5):463468.

　　[8]  WitkoSarsat V,Gausson V,DescampsLatscha B. Are advanced oxidation protein products potential uremic toxins[J]? Kidney Int, 2003,84(Suppl):1114.

　　[9]  Grillo C A,Piroli G G,Rosell D R,et al. Region specific increases in oxidative stress and superoxide dismutase in the hippocampus of diabetic rats subjected to stress[J]. Neuroscience， 2003,121(1):133140.

　　[10]  Kimura F,Hasegawa G,Obayashi H,et al. Serum extracellular superoxide dismutase in patients with type 2 diabetes: relationship to the development of micro and macrovascular complications[J]. Diabetes Care, 2003,26(4):12461250.

　　[11]  郑  辉,王中心,吴长珠,等. 糖尿病患者血中NO、LPO、SOD的变化及临床意义[J]. 福建医科大学学报, 1999,33(4):398401.

　　[12]  Je H D,Shin C Y,Park H S,et al. The comparison of vitamin C and vitamin E on the protein oxidation of diabetic rats[J]. J Auton Pharmacol, 2001,21(56):231236.