芳香烃受体与原因不明自然流产关系的初步研究

现代生殖免疫学认为妊娠是一种半同种异体移植，其成功与否受到母体、胚胎及母胎界面等多方面因素的影响。母胎之间形成的免疫耐受起着重要的作用，一旦此免疫平衡被打破，将会导致自然流产的发生。 目前，尽管有较多证据表明原因不明自然流产的发生与机体免疫异常有关，如Fast的缺失[1]，多种趋化因子受体和胸腺基质淋巴细胞生成素表达异常[2,3]，自然杀伤细胞(natural killer, NK)抑制性受体/激活性受体、Thl /Th2 , Treg/Th17免疫平衡失 调4一6等，但其确切机制尚不清楚。有研究发现芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor, AhR)作为一个配体激活转录因子，以配体依赖的方式调节reg/ Th17的平衡。当初始T细胞中AhR被其配体四氯二苯对二德英(2，3.7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin， TODD)激活时,'T细胞可向Treg分化;而当AhR被另一种配体FICZ激活时一，初始T细胞则向Th17分化。 以往研究吕发现AhR作为外来物质适应性反应的介导者，在正常生理和胚胎发育中起着重要作用，参与细胞生长、浸润和凋亡，亦可参与病理过程的发生，如动脉粥样硬化斑块的形成。AhR与原因不明白然流产的关系如何，是否参与免疫耐受Treg/Th17 的平衡失调，抑或调节母胎界面蜕膜细胞和滋养细胞功能改变，是通过何种方式影响妊娠结局，目前尚未见文献报道本研究通过检测AhR在原因不明自然流产患者蜕膜和绒毛组织扫的表达，初步探门一其在流产中的作用对象与方法.

1.1研究对象

1.1.1流产组2011年l2月一2012年4月于上海交通大学医学院附属仁济医院妇产科行难免流产刮宫的原因不明自然流产患者34例，其中发生过自然流产1次者19例，流产2次者7例，流产3次及以上者共8例;患者平均年龄(30. 29 1 4. 23)岁，平均孕周(10. 6士0. 6)周. 1.1.2刘一照组选择同期行人工流产的38例正常孕早期(孕7一9周)妇女作为对照组。B超下胚胎发育正常，既往有正常足月产史，尤自然流产史，无早产、死胎、死产、异位妊娠等不良生育史;平均年龄 (29. 61士4. 80)岁，平均孕周(8. 7士0.7)周. 1.1.3纳人标准两组研究对象人选条件:①无子官、宫颈疾病;②无感染性疾病;③无自身免疫性疾病;④无内分泌代谢紊乱性疾病;⑤丈夫精液正常; ⑥夫妇双为一染色体核型正常。所有研究对象均签署知情同意书，研究计划经医院伦理委员会同意。

1.2方法

1.2. 1标本采集在无菌条件下收集两组妇女蜕膜及绒毛组织，用磷酸缓冲液(PBS)洗净血块，剪取约100 mg,组织，加人1 mL TPiIzol试剂(Invitrogen )，剪碎后超声粉碎，置于一80℃冰箱保存，以备Rn A提取。同时剪取适量组织置于EP管中，置于一80℃冰箱保存，以备蛋白质提取. 1.2.2 Real-Time PCR测定蜕膜及绒毛组织中AhRh mRNA的表达从一80℃冰箱取出加有TRIzoI试剂的组织，待其溶解后加人200闪三氯甲烷于固定组织的1 mLTRIzol试剂中，剧烈混匀后静置2 - 3 min , 4 0℃下12 000 r/min离心15 min，吸取上清，加人等量异丙醇，混匀后静置5 min,4℃下12 000 r/min离心10 min;弃上清，加人1 mL无水乙醇，摇匀后4℃ 下12 000 r/mi。离心15 min ;弃上清，待其干燥后加人适量DI;PC水溶解RNA。按照TaKaRa反转录试剂盒说明将RN;4反转录为cDNA , Real-Time PCR引物根据GenBank提供的AhR和GAPDH基因序列，由TaKalia公司设计并合成。AhR上游引物为TGTCGTCTAAGGTGTC'I'GCTGGA，下游引物为 AAGCC A:}C'I'GAGGTGGA AGT A'I"I'G:4，扩增产物130 bp; G APDH上游引物为GCACCG'1'CAAGGCTGAGAAC , G APDH下游引物为TGGTGA AGACGCCAGTGGA ,扩增产物138 bp扩增步骤参照TaKaRa ( DDR081 A 试齐盒.扩增条件:95℃30 s ; 95℃ 5 s , 60 ℃ 20s， 40个循环;65℃15s。使用LightCvcler ( Roche Diag- nostics Co.)进行扩增反应和C值计算计算公式:△口 =C, ( AhR)一Ct( GAPDH) , AhR mPLNA相刘一表达量为 2一△Ct。 1.2.3 Western blotting法测定蜕膜和绒毛组织中 Ah R蛋自的表达取冻存组织约50 mg，加人200 P,L 蛋白裂解液，剪碎后超声粉碎组织;于冰上裂解 30 min后，12 000 r/m i r，离心20 min，吸取上清，加人上样缓冲液于100℃水浴中煮10 min，于一20℃保存，以备蛋白电泳。配制10 % 十二烷基磺酸钠一聚丙烯酞胺(SDS-PAGE )凝胶电泳，上样、转膜、封闭，依次加入一抗AhR ( Abcam,1:400 ) , GAPDH ( AbMart, 1:5 000)和二抗(LI-COR , 1 : 10 000，采用Li-COR ODYSSEY远红外荧光显色。采用Image J软件计算灰度值并分析蛋自相对表达量。

1.3统计学方法 应用SPSS 18. 0软件进行统计分析，结果以x±s 表示，组间比较采用t检验,P <0.05为差异有统计 学意义。

2结果

2.1蜕膜和绒毛组织中AhR mRNA的表达 流产组和对照组蜕膜和绒毛组织均表达Ah R mRNA。流产组和对照组绒毛组织中Ahli mPLNA相对表达量均明显高于蜕膜组织(P < 0. 01);流产组蜕 膜和绒毛组织中AhR mRNA相对表达量均明显高于对照组(P<0.01)(表1).

2.2蜕膜和绒毛组织中AhR蛋白的表达 蜕膜和绒毛组织中均有AhR蛋白的表达。流产组和对照组绒毛组织中AhR蛋白的表达均明显高于蜕膜组织(P<0.05);流产组蜕膜和绒毛组织中AhR 蛋白的表达均明显高于对照组(P < 0. 05)(图1).

3讨论

现代免疫学的观点认为，正常妊娠之所以能够维持主要取决于母胎面免疫关系的平衡，即妊娠免疫耐受的形成。一旦这种耐受机制被打破，即导致病理妊娠，如习惯性流产等。尽管有大量证据表明蜕膜免疫活性细胞，如NK细胞、T细胞、巨噬细胞等参与了母胎免疫耐受，但其机制尚不完全清楚。上述细胞免疫机制正常与否，主要受Treg和Th17细胞之间的平衡调节。Treg/Th17平衡向Th17细胞偏离在自然流产的发生和发展过程中发挥重要作用，而 AhR作为一个配体激活转录因子，以配体依赖的方式调节Treg/Th17的平衡。因此，本研究在前期研究基础上观察AhR在原因不明自然流产患者及正常妊娠妇女子宫蜕膜及绒毛的表达情况，期待通过激活 AhR向不同方向发展来调节Treg/Th17平衡，从而为原因不明自然流产提供新的治疗途径。

3.1 AhR特点及表达分布 AhR作为一种环境毒素TCDD特异性结合位点而被发现，有一个基本的螺旋环结构，作为配体激活的转录因子，可与多种物质相结合。AhR存在于大多数细胞的细胞质中，与其他几种蛋白形成受体复合体，一旦与配体结合则易位至细胞核，与AhR核转运子(AhR nuclear translocator, Arnt)结合，形成异构体。该异构体结合基因启动子中的识别位点，激活相关基因的转录，包括前列腺素合成酶H2和外源性代谢酶CYP1 A1(细胞色素P450 ) [9]。近年来，对 AhR的研究主要集中于肿瘤和T细胞调节，如人类 Ishikawa子宫内膜癌细胞中表达AHR[10]，胃癌组织和胃癌细胞系中AhR表达明显增高”，肺腺癌中也发现其高表达[12];AhR与不同的配体结合可以影响细胞功能和调节Thl/Th2 ,Treg/Th17平衡[9,13],对免疫状态的调控有重要作用。 研究发现母胎界面也表达AhR正常足月分娩的胎盘主要在合体滋养层细胞表达AhR妊娠中期胚胎有许多组织都表达AhR，如肺、肾、食管、胰腺、肝脏、肇丸、胸腺等，主要表达于上皮细胞，但在心、脑、胸主动脉中无表达[14]。研究[15]表明，孕早期胚胎和蜕膜组织及孕前子宫内膜均表达AhRo Lindenau 等[6,17]以AhR配体喂养雌兔，发现该物质在生殖道、子宫分泌物和种植前囊胚中聚集，大部分物质转移至种植的胚胎和蜕膜组织中，若用AhR配体培养胚胎，会显著影响其发育，提示AhR及其配体在生殖和胚胎发育过程中有着重要作用。

3.2 AhR在母胎界面的可能调节机制 AhR是否参与病理妊娠过程尚缺乏研究证据。有学者[14]发现正常足月分娩的胎盘AhR表达量与重度子痈前期患者胎盘中表达量无差异，提示AhR 可能不参与子痈前期的发病机制。AhR是否参与其他病理妊娠未见报道，因此，本研究检测原因不明自然流产和正常妊娠妇女蜕膜及绒毛组织中AhR的表达，以期探讨其在流产中的作用及机制。

本实验结果显示，无论是对照组还是流产组，绒毛组织中AhR的表达量均高于蜕膜组织。Peter等[18]发 现，小鼠种植前胚胎中表达AhR，干扰AhP可降低囊胚的形成率，AhR是胚胎发育过程中重要的蛋白。绒毛是胚胎发育的初级阶段，各胚层还未完全分化，与完全分化的蜕膜相比需要各种蛋白的表达维持分化的正常进行，因此，绒毛组织内蛋白表达高于蜕膜组织。 流产组蜕膜组织和绒毛中AhR的表达量均高于刘一照组，提示原因不明自然流产可能与AhR表达增高有关系。因为AhR配体可在生殖道和胚胎中聚集，这种聚集可增强局部AhRh的表达，配体与Ah F1 结合参与各种生理病理过程，而部分AhR配体具有胚胎毒性;因此，原因不明自然流产中AhR的高表达可能导致胚胎和蜕膜受到配体更多的作用，影响胚胎发育、形态、大小和细胞增殖，出现病理妊娠。原因不明自然流产患者母胎界面存在T细胞失衡，而 AhR在不同T细胞中表达有差异，也可能是出现 AhR增高的原因之一。

许多研究在体外实验中证明了Ah R通过结合不同的配体可使初始T细胞分化为不同的免疫细胞，如Treg和Tn17细胞;在体内研究中也发现，使用4hR配体TCDD处理小鼠后可减轻自身免疫疾病模型小鼠的疾病程度，如脑脊髓炎、多发性硬化[17,19]、结肠炎[20]、视网膜炎[21]等，并且是通过上调Treg实现的，若使用AhR另一种配体F1CZ. 则会通过促进Th17细胞分化而加重自身免疫疾病程度。可见AhR及其配体在维持免疫系统平衡及目身免疫疾病中起着重要作用，而母胎界面的免疫反应十分复杂，其中Treg/Th17失衡与自然流产关系密切，推测AhR也在一母胎面的免疫调节中有一定作用， AhR可能通过干扰Treg/Th17平衡而影响妊娠结局。 AhR表达广泛，功能多样，通过与不同的配体结合可能影响胚胎发育，亦可能调节母胎面免疫平衡。本研究发现原因不明自然流产患者中芳香烃受体表达增高，为原因不明自然流产的机制研究提供了一个新的方向和思路。

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