Caspase-8在慢性肝炎患者肝组织中的表达及意义

细胞凋亡(apoptosis)又称程序性细胞死亡(pro- grammed cell death, PCD)，是机体细胞在受到生理和病理性刺激后出现的一种自发的死亡过程，是机体为保持内环境稳定，由基因控制的细胞自主有序的死亡。当细胞凋亡的过程发生异常，则可能会引发组织细胞凋亡过多造成疾病的发生。肝细胞凋亡是造成肝脏损伤和肝脏疾病最基本的中心环节，慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎和非酒精性脂肪性肝炎的发病机制均与肝细胞凋亡关系密切「‘一‘〕。本研究通过检测肝炎肝组织中 细胞凋亡及其主要效应分子(Caspase一8)的表达，探讨两者在肝炎的病理生理过程中的作用。

1资料与方法

1. 1一般资料选用2011年一2012年于唐山市传染病医院就诊的慢性乙型肝炎患者70例，慢性丙型肝炎 50例，以上诊断标准符合2000年修订的《病毒性肝炎防治方案》[5」，非酒精性脂肪性肝炎50例(除外病毒性肝炎、药物性肝病、全胃肠外营养、肝豆状核变性等可导致脂肪肝的特定疾病)。另选用同期15例非肝脏疾病死亡的正常肝组织作对照。所选病例行肝穿活检，标本常规用10%中性甲醛固定，石蜡包埋。

1.2方法

1.2.1临床肝脏组织活检66例患者均进行1 s肝脏穿刺术，所获取标本用10%甲醛溶液固定，常规石蜡切片，行HE染色，免疫组化检测病毒标志物，采用 2000年修订的《病毒性肝炎防治方案》制定的标准5〕，将肝脏炎症活动度分为4级(GO一G4)，纤维化分为4期(SO一S4)。

1.2.2血清A LT检测采血约5 ml后，即刻以3000 r/min离心10 min，取上清液置于一70℃冰箱中保存待检。ALT检测采用全自动生化分析仪。ALT , 40 U/L为正常，ALT > 40 U/L为异常。

1.2.3 Caspase一8检侧采用免疫组织化学染色PV 两步法检测肝组织中Caspase一8的表达。按常规程序操作，一抗工作液浓度:Caspase一8 1: 50 , DAB显色，设阳性和阴性对照，阴性对照采用PBS代替一抗。 Caspase一8的阳性表达为细胞浆和细胞核中有棕黄色颗粒。每个切片随机选取不重叠5个高倍视野 (400倍)，用Motic Med数码医学图像分析系统分别测定每个视野阳性染色部位的光密度，取其平均值即得切片的平均光密度值。用平均光密度代表Caspase一8 在肝组织中的表达水平。每例组织切片随机观察5个高倍视野，阳性细胞数,10为阴性，>10%为阳性兔抗人多克隆抗体Caspase - 8试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2.4细胞凋亡的检测采用TdT介导的脱氧核甘酸切口末端标记法(TdT mediated UTP nick end labe- ling, TUNEL)检测肝细胞凋亡。

1.3统计学分析采用SPSS 16. 0软件对数据进行 Xu检验、Eisher' s test及Spearman等级相关分析，以 P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2. 1镜下观察结果常规HE染色以准确判断肝内炎症，肝组织结构改变及纤维化程度，镜下观察结果: 细胞核深蓝色，胞浆及纤维组织呈深浅不等的红色。 TUNEL检测的凋亡的细胞表现为胞膜完整、核改变，见核固缩及染色质边聚，细胞核有棕黄色颗粒(图la 一d) ; Caspase一8在慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎及非酒精性脂肪性肝炎肝组织中的阳性染色主要定位于细胞浆和(或)细胞核，呈棕黄色，见图2a一d}

2. 2临床资料研究对象共170人，< 30岁组38人，30 一45岁组114人，> 45岁组18人;研究对象的年龄构成见表1，不同肝炎类型患者的年龄构成差异无统计学意义 (,Y2 =3.928,P=0.416);慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎及非酒精性脂肪性肝炎三组肝炎患者肝组织病理分型比较差异无统计学意义(x2 -o. i9i,p -o. }6}(表2)，表明三组研究对象年龄构成、病理分型构成相同，各组临床资料具有可比性。

2.3 Caspase一8的表达与肝细胞凋亡Caspase一8在慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎、非酒精性脂肪性肝炎中的表达分别为58.6% ,64.0% ,82.0%，高于正常肝组织的表达(13.3%)，差异有统计学意义(P < 0. OS );并与肝细胞凋亡密切相关(r = 0. 409，P< 0. 001)(表3) o Caspase一8在慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎及非酒精性脂肪性肝炎中的表达明显高于正常肝组织，差异有统计学意义(P<0.05)。Caspase- 8在非酒精性脂肪性肝炎中表达明显高于慢性乙型肝炎，差异有统计学意义(P < 0. OS ) ; Caspase一8在慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎中的表达差异，无统计学意义(P > 0. OS ) o Caspase一8在三种病理类型肝组织中的表达存在差异(P <0.05)，进一步分析Caspase一8 在重型肝炎中的表达阳性率最高，轻型肝炎表达阳性率最低，差异有统计学意义(P<0.05)。

2. 4 Caspase - 8表达与AL`1'水平的关系检测患者 ALT水平，将各肝炎类型的患者分为ALT , 40与ALT > 40两组，结果发现Caspase一8在不同ALT水平肝组织中的表达差异无统计学意义(Y>0.05)(表5)0 3讨论 细胞凋亡是指细胞在内、外因子的严格控制下一种有步骤有活性的生理性白行消亡的过程。1993年 Yuan等6观察到CED3在秀丽隐杆线虫细胞的细胞凋亡过程中的作用，从而第一次提出Caspase、与细胞凋亡的紧密联系本研究显示，Caspase - 8在慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎及非酒精性脂肪性肝炎肝组织中的表达与TUi\EL检测的肝细胞凋亡的表达具有良好的相关性因此，Caspase - 8的表达能较准确地反映肝组织的凋亡程度。 肝脏细胞凋亡是很重要的肝脏损害发展因素。通常凋亡细胞的清除是一个不伴有炎症的过程，然而在肝细胞的凋亡过程中可检测到细胞内酶，当凋亡肝细胞数量超过肝组织清除能力时，组织结构的破坏将导致炎症{}i，进而激活星状细胞，直接促使肝纤维化及肝硬化。本组结果也显示慢性肝炎肝细胞凋亡均高于正常对照组，随着病理程度加重细胞凋亡指数也上升。同时，Caspase - 8在非酒精性脂肪性肝炎中表达明显高于慢性乙型肝炎，在慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎中的表达未见差异。提示细胞凋亡在肝炎的病理生理过程中起着重要作用。 细胞凋亡发生在乙型、丙型肝炎时，机体为维持自身生理状态，细胞结构发生变化:细胞质和染色体浓缩，大量凋亡小体形成，可见大量点状坏死及碎屑样坏死的肝小叶，即以细胞凋亡的形式停止细胞代谢，阻止病毒的复制，清除病毒感染的细胞。同时肝脏功能受影响二可见肝损伤实质主要是肝细胞凋亡。非酒精性脂肪性肝炎起因很复杂，目前认为主要是由于继发于胰岛素抵抗而发生的脂解作用增加所导致的肝细胞脂肪沉积，进而脂肪过氧化造成肝细胞脂肪变性时产生活性氧族而引起氧化应激，进而导致了细胞凋亡的Caspase家族级联反应的发生、并生成一些细胞因子引起炎症反应和出现肝星状细胞激活而引起纤维化。本组研究显示，Caspase一8在非酒精性脂肪性肝炎中表达明显高于慢性乙型肝炎，在慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎中的表达未见异常。Caspase一8 在非酒精性脂肪性肝炎高表达可能由于非酒精性脂肪性肝炎与众多危险因素关系密切:诸如肥胖、11型糖尿病和高脂血症、空肠一回肠短路手术和小肠细菌过度繁殖及药物和毒物等。

作者对Caspase一8表达和所选病例(治疗后) aLT进行相关统计分析并未发现明显相关性(P> 0. OS。这是否与Caspas。一8和ALT之间还有许多影响因素及环节有关，尚有待进一步研究。

参考文献

[1] Jaeschke H,Gujral JS,Bajt ML . Apoptosis and necrosis in liver disease . Liver International , 2004年 24卷 第02期

[2] 中华医学会传染病与寄生虫病学分会,中华医学会肝病学分会 . 病毒性肝炎防治方案 . 中华肝脏病杂志 , 2000年 8卷 第06期

[3] Schattenberg JM,Galle PR,Schuchmann M . Apoptosis in liver disease . Liver International , 2006年 26卷 第08期

[4] Ribeiro PS,Cortez-Pinto H,Sola S . Hepatocyte apoptosis,expression of death receptors,and activation of NF-kappaB in the liver of nonalcoholic and alcoholic steatohepatitis patients . American Journal of Gastroenterology , 2004年 99卷 第09期

[5] Yuan J,Shaham S,Ledoux S . The C.elegans cell death gene ced-3 encodes a protein similar to mammalian interleukin-1 beta-converting enzyme . Cell , 1993年 75卷 第04期

[6] Feldmann G . Liver apoptosis . Journal of Hepatology , 1997年 26卷 第Suppl 2期

[7] Casey CA,Lee SM,Aziz-Seible R . Impaired receptor-mediated endocytosis:its role in alcohol-induced apoptosis . Journal of Gastroenterology and Hepatology , 2008年 23卷 第01期