大肠埃希菌质粒介导的耐药机制研究进展

大肠埃希菌是感染性疾病重要的革兰阴性致病菌，近年来国内外对其耐药机制进行了大量的研究，其中质粒介导的耐药是一种重要的机制。质粒是细菌染色体以外的遗传物质。在全球范围内大肠埃希菌的质粒能将其耐药性广泛横向传播和接受外源性的耐药性,从1962年R质粒的发现以来,近年来在我国Qnr质粒，DHA1[1],QepA质粒,质粒介导的165rRNA甲基化酶，质粒介导的Ampc酶这些耐药质粒不断被发现,100KB以下的质粒最常见。在国外,NDM-1基因，耐β内酰胺酶中的ACC-4，PMB1和P15A，pET-30a (+)，CTX-M，KPC-3质粒最常见. 大肠埃希菌耐药性通过质粒,在人类之间，人类和动物之间相互传播和转移[2]。
1国外质粒介导的耐药现状
美国 2007年报道了在大肠埃希菌质粒编码来源于头孢菌素ACC-1的ACC-4，在耐β内酰胺酶中更重要，它是哈夫尼菌属中来源于头孢菌素酶ACC-1最后一个环状的突变体[3]。同年英国报道了PCR2复制子在大肠埃希菌表达型载体的发展,研究发现，不同的抗生素耐药性标志被引进载体中，发现在没有选择压存在的情况下复制稳定性达到100% 。这种质粒高的兼容性被认为和不同大肠埃希菌质粒复制子PMB1和P15A有关，在没有选择压下，PCR2能和这种大肠埃希菌质粒共存60代，这就能够保证大肠埃希菌耐药性质粒传播的稳定性[4]。

2009年美国德州农业研究机构用蠕甲虫实验，证实了抗生素的抗性质粒在沙门氏菌属和大肠埃希菌之间的转移，这是第一次用实验证实了大肠埃希菌可以接受外源性的耐药性[5]。2009年中国微生物学报向国内外报道,KHG2是指能在LB培养基含有70MG/LHGCL2上生长的细菌,这种菌株96%的基因序列与杆状菌的模式菌株DSM12223T相同,他的形态特征和生理学和生物化学性质都与这种细菌一致.通过PCR技术在这种菌株中获得1680BP的片段,它与恶臭假单胞菌MERA基因99%的序列是相同的。经过PCR扩增后克隆到PET-30A(+)向量获得一个表达质粒PZY-2,这个表达质粒可以被转化进入大肠埃希菌中,生成表达株E. coli BL21 (DE3) x pZY2, 通过isopropyl-b-D-thiogalactoside (IPTG)诱导后生成一个33KDA的蛋白质。 重金属抗性实验表明这种表达株能在含20 mg/L HgCl2的LB培养基上生长,和对照组相比, pET-30a (+)不能生长在含有20 mg/L HgCl2的LB培养基上[6],表明通过大肠埃希菌转移,沙门氏菌表达质粒获得了对抗生素的抗性。这类试验这些年报道极少。这是细菌之间相互传播耐药性的最好证明。

2010年以色利的特拉维夫报道证实了在人类肺炎杆菌肺炎中耐碳青霉烯类抗生素KPC-3质粒在对碳青霉烯类敏感的大肠埃希菌中容易水平传播[7]，造成了大肠埃希菌对碳青霉烯类的耐药，变得丧失了敏感性，以产ESBLs最明显。最近的全球调查包括17个国家的3049家医院，对于左旋氧氟沙星敏感性，大肠埃希菌(产ESBLs)50%，(不产ESBLs)81.4%,另一份SENTRY调查报告显示了从48所美国医疗监控中心分离的65746株菌对环丙沙星的敏感率，大肠杆菌(产ESBLs)68.7%，不产(ESBLs)81.4%[8]。醛诺酮类抗生素是目前应用最广泛的抗生素之一,从这份调查看,它的耐药性是惊人的。

法国的微生物学杂志最近报道,研究人员探索了CTX-M质粒的基因和大肠埃希菌染色体基因之间的关系,证实了CTX-M编码质粒可以通过低数量的肠外致病基因获得,表明CTX-M的获得可以出现在大肠埃希菌菌株[9]。大肠埃希菌对CTX-M基因获得起了重要的宿主作用。2011年在伊朗的Sanandaj大学医院住院病人的病例对照研究,表明大肠埃希菌的染色体和质粒对头孢吡肟耐药性的获得主要与头孢吡肟的使用,数日住院,空调的使用,医用导管的使用等有关。表明细菌耐药性的获得与医院是一个相互作用的过程。

2011年日本最新报道了,新德里NDM-1基因,来自于质粒的抗性基因,编码一个特别的广谱内酰胺酶,能够水解多种多样的内酰胺酶,包括碳青霉烯类。第一次被报道的是一个克雷伯杆菌肺炎病人,一个起源于印度的瑞典人,表明这个基因在全球广泛分布和漫延。在这种研究中,研究人员以NDM-1阳性ST38为特征,大肠埃希菌菌株NDM-1 Dok01,来源于一位54岁的日本住院病人血液,此人以前曾经去过印度。研究主要是通过细菌表面结构联系毒力,细菌的培养包括集落突变,在血琼脂培养基上培养出的包括光滑型菌落和粗糙型菌落。光滑型菌落子代M1有抗血清荚膜,对抗血清抵抗性,而粗糙型血清的突变体子代B2没有荚膜,对抗血清高度敏感。这个研究反映了由于表面结构的不同,细菌子代M1有更多的鞭毛和自动性,而子代B2几乎没有鞭毛和只有5um的垂直菌毛。他们在插入人类肠道细胞和细菌的自身攻击方面起到了作用[10]。证据表明bla (NDM-1)-positive ST38 E在日本出现有荚膜,有潜在毒力在血液中的细菌性病原体。

2国内质粒介导的耐药现状

吉林大学白求恩医学院最近的研究，从两株大肠埃希菌中提取出了两种耐药性质粒，其分子量均为3.0Kb左右，其转化子对青霉素、氨苄西林、红霉素、阿奇霉素、头孢哌酮钠、盐酸环丙沙星耐药，对头孢噻肟、头孢曲松敏感。

2007年安徽省检测质粒介导的Ampc酶对多种抗菌素耐药，以头孢吡肟，美罗培南，亚胺培南相对较敏感[11]。同年,上海第六人民医院报道,发现的CIT群质粒AmpC酶均为CMY-2型，也是在上海地区第1次发现CMY-2型质粒AmpC酶[12]。CMY-2型质粒AmpC酶合并ESBLs的检出率较高，主要与CTX-M-14型ESBLs同时存在。本研究第1次该院发现耐碳青霉烯类药物的大肠埃希菌，新耐药菌株的出现给临床用药的选择和院内感染的控制提出了新的挑战。

2011年1月中国的微生物杂志报道了我国几所大学联合研究,来自猪,农业工人,环境的大肠埃希菌,用PFGE,多腔序列分类,系统进化分析法,限制性核酸内切酶消化,DNA杂交分析,PCR定位技术等等,研究发现携带着qepA和rmtB的IncFII 质粒对阿米卡星和氟喹诺酮类有高度的耐药性。 qepA和rmtB位于大约 75-kb IncFII的结合性质粒上。Tn3,IS26,ISCR3发现与qepA和rmtB相关联.这是第一次发现在大肠埃希菌中qepA和rmtB在猪,农业工人,环境中的传播. IncFII质粒水平转移和克隆传播的存在有助于这种抗药基因在猪农场的传播[13]。

3质粒介导的耐药机制

上个世纪抗生素的出现和发展与后来的广泛应用使许多由大肠埃希菌引起的疾病得到了很大程度的控制,治愈了许多患者和挽救了不少人的生命。但是,近20多年来其发病率和病死率反而居高不下, 临床治疗困难,尽管抗生素种类较多。同时,由于抗生素的滥用,无限制,无选择的使用.促使大肠埃希菌产生了一种或者两种甚至多种抗生素的耐药性。产生耐药的机制十分复杂,耐药性主要由染色体或耐药质粒(R质粒) 介导,R质粒是最常见的,可通过接合、转化、转导等方式在相同和不同菌种之间传递,使敏感菌成为耐药菌株,造成了R质粒的流行 。R 质粒的传递使得耐药性在细菌与细菌之间广泛横向传播,又使一部分体内正常菌群成为耐药菌株,大大增加了防治的难度。

细菌质粒的耐药性传播与质粒的大小和种类有关。Qnr质粒，QepA质粒,质粒介导的165rRNA甲基化酶，质粒介导的Ampc酶;100kb以下的小质粒，均与细菌的耐药性有关。不同的医院其耐药性质粒种类也是有一定区别。

大肠埃希菌耐药性的遗传信息主要存在于质粒上,而质粒又能以不同的方式在菌株之间以较高的频率转移，从而使抗药性能够以快速传播。国内外的研究均表明,大肠埃希菌对喹诺酮类有较高的耐药性,以产ESBLs酶的细菌最明显。

大肠埃希菌也会接受来自外源性的质粒获得新的耐药性。PHH205就是这种质粒,携带着这种质粒的细菌可以将本身的耐药性传播给大肠埃希菌。 还有,重组质粒pSDR12在大肠埃希菌中表现出较高的Tc抗性。废水中的耐药菌也可以将耐药性通过质粒介导传播给大肠埃希菌,耐药性的获得都是曾经用过这种抗生素的人或者动物。

大肠埃希菌产超广谱β-内酰胺酶可以由质粒编码，质粒DNA上的ESBLs编码基因常常可以在结合性质粒的tra操纵子，非结合性质粒的启动系统(oriT及mob基因)，转座子(Tn)以及整合子(Int)的作用下通过转化，转导,结合等方式在同种属甚至不同 种属细菌的质粒之间或者质粒与染色体间不断转移，导致更多的细菌产生ESBLs，并通过整合和重组使细菌产生多重耐药性。

4小结

21世纪以来,大肠埃希菌被认为与很多人类的健康问题密切相联。它们造成了很多的感染性疾病,同时也改变了细菌性疾病的生态学。由于抗生素的广泛使用和不加选择的滥用,造成了细菌通过耐药性质粒的传播,很容易获得一个多样的耐药性。新的手术操作的发展，健康支持技术,治疗方法的进展,给细菌入侵提供了新的门户,而且,机体在一定程度上也缺乏这方面的免疫力。

大肠埃希菌的耐药性呈全世界广泛分布。清楚细菌的耐药机制十分必要,随着国内外研究的深入,不断有新的耐药机制被发现,这就为我们研究新的对抗耐药细菌的药物指明了方向,同时,更重要的是应对抗菌药物在人类和动物的使用加以严格管理和限制,才能对耐药菌的产生和传播进行有效的预防,遏制细菌耐药的加剧，避免人类治疗疾病陷入无药可用的尴尬境地，因为细菌变异耐药的程度远快于新抗生素发明的速度。

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